2.3.1 .Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
2.5. Thẩm định phương pháp
Thẩm định phương pháp LC-MS/MS phân tích theo hướng dẫn thẩm định của dược điển Việt Nam, dược điển Châu Âu, hướng dẫn của UNODC…. Tiêu chí thẩm định phương pháp gồm [25, 26]:
2.5.1. Độ phù hợp của kệ thống sắc ký
Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp một mẫu chuẩn hỗn hợp có hàm lượng nằm trong khoảng tuyến tính. Ghi lại thời gian lưu và diện tích peak của các lần sắc ký. Độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) biểu thị chênh lệch diện tích peak, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu không lớn hơn 2,00 %.
2.5.2. Độ chọn lọc của phương pháp
Để đánh giá tính chọn lọc của phương pháp, thực hiện phân tích và so sánh phổ của các chất phân tích trên 3 mẫu: mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn. Mẫu trắng khơng được lên tín hiệu chất phân tích, mẫu thêm chuẩn phải có tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng thời gian lưu trên mẫu chuẩn.
2.5.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có hàm lượng thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào hàm lượng. Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích peak thu được vào hàm lượng cho đến khi khơng cịn tuyến tính.
Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích. Các bước xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu:
- Lựa chọn nền mẫu trắng phù hợp với đối tượng thử, trong nghiên cứu này các đường chuẩn trên nền mẫu huyết tương.
- Pha dãy chuẩn trên nền mẫu trắng.
- Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu của từng chất và tín hiệu của nội chuẩn theo hàm lượng các chất tương ứng.
Các đường chuẩn được đánh giá dựa trên:
- Hệ số tuyến tính R2 ≥ 0,99
- Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn.
2.5.4. Độ đúng và độ chính xác
- Độ đúng R (%) được tính theo cơng thức:
𝑅% = Cm
x 100 Cc
Cc : Lượng THC-COOH chuẩn
Độ chính xác được biểu diễn theo hệ số biến thiên CV (%):
𝐶𝑉(%) = 𝐬
x̅x 100; với s =
Trong đó:
xi: Hàm lượng tính được của lần thử nghiệm thứ ―i
x̅ : Hàm lượng trung bình tính được của n lần thử nghiệm. N: Số lần thử nghiệm.
s: Độ lệch chuẩn.
2.5.5. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng
Trong nghiên cứu này, LOD và LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu đường nền (S/N = Signal to noise ratio): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở hàm lượng thấp cịn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Xác định S/N dựa vào phần mềm của thiết bị.
LOD là hàm lượng mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3). LOQ là hàm lượng mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10).