- Khảo sát pha động: Tiến hành khảo sát 3 hệ pha động hệ 1, hệ 2 và hệ 3 dựa theo các nghiên cứu đã được tìm hiểu [22], để chọn hệ pha động có khả năng tách, thời gian lưu phù hợp và cho các peak cân đối thuận lợi cho phân tích định lượng. Chuẩn bị hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml và nội chuẩn 100 ng/ml, Tiến hành khảo sát trên thiết bị ở 3 hệ dung môi thay đổi nồng độ Amoniacetat 2 mM, 5 mM và 10 mM ở pha động A còn cố định pha động B: ACN và MeOH (85:15)
Kết quả được trình bày dựa trên sắc ký đồ thu được như sau:
Hình 3. 2. So sánh Peak THC-COOH ở 3 nồng độ Amoniacetat khác nhau (a) 2 mM, (b) 5 mM và (c) 10 mM
Như vậy, dựa vào sắc ký đồ trong 3 hệ dung mơi thì mặc dù ở nồng độ
10 mM có cho diện tích peak cao nhưng khơng ổn định do ảnh hưởng nồng độ muối Amoniacetat ở nồng độ cao, mặc dù trong quá trình pha dung dịch
(a) (b) 299.2 245.1 191.1 302.1 248.1 194.1 (a) (b) (c)
muối đã lọc qua màng lọc nhưng trong q trình tiến hành phân tích thì muối vẫn bị tạo kết tủa 1 phần dẫn đến khi chạy thì pha động khơng đạt đúng nồng độ 10 mM và ảnh hưởng đến quá trình tách của pha động và ảnh hưởng cột tách, nên diện tích peak lúc cao lúc thấp khơng ổn định như vậy ảnh hưởng đến kết quả định lượng chất phân tích. Mặt khác nếu q trình tạo muối diễn ra trong thời gian dài sẽ đóng bám kết tủa vào cột thì sẽ làm hỏng cột. Như vậy dựa vào sắc ký đồ thì hệ dung mơi 2 (5 mM) cho peak đặc trưng nét và ổn định, phổ khối của các mảnh phù hợp với cơ chế phân mảnh của THC- COOH, thời gian phân tích nhanh hơn cịn hệ dung mơi 1 (2 mM) khả năng tách kém cho peak không rõ ràng và thấp. Do vậy, lựa chọn hệ dung môi 2 và các điều kiện như trình bày chương 2 để phân tích.
3.2. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết
3.2.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Đối với phương pháp chiết lỏng - lỏng, dung mơi đóng vai trị quan trọng trong việc tách chiết các chất phân tích ra khỏi hỗn hợp. Tiến hành lựa chọn dung môi chiết cần thỏa mãn các tiêu chí như sau: Dung mơi khơng hịa tan trong nước, ít độc, dễ kiếm (tương đối thông dụng, thường dùng trong các phịng thí nghiệm phân tích), nhiệt độ sơi thấp (để dễ bay hơi khi đuổi dung môi ra khỏi dịch chiết), dễ phân tách khi chiết xuất. Ngồi ra có thể xem xét thêm các yếu tố như an toàn cháy nổ và khả năng gây kích ứng khi người phân tích tiếp xúc.
Dựa vào các tiêu chí về lựa chọn dung mơi và qua nghiên cứu các tài liệu tham khảo, ở đề tài này chúng tôi tiến hành lựa chọn hai dung môi hexane/etylaxetat ở 6 tỉ lệ khác nhau để khảo sát khả năng chiết THC-COOH. Tiến hành lấy 1 ml huyết tương trắng, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH 200 ng/ml, dùng axit TCA vừa kết tủa protein vừa để điều chỉnh pH, thay đổi tỷ lệ dung môi gồm 100% hexanee và hỗn hợp hexanee/etylaxetate: 9:1, 8:2; 7:3; 6:4 và 5:5. Chiết các mẫu theo quy trình tại giá trị pH tối ưu 4, thêm 10 μl dung dịch THC-COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào dịch chiết. Làm khơ hồn tồn và hịa tan lại cặn bằng 20 μl dung môi. Tiến hành khảo sát trên thiết bị và so sánh trực tiếp với hỗn hợp chuẩn 100 ng/ml không xử lý. Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình.
Trong thí nghiệm lấy 1 ml huyết tương vì trong thực tế giám định thì thường cơ quan trưng cầu gửi lượng máu không nhiều chỉ khoảng 3 ml đến
5 ml máu, lượng mẫu vừa để phân tích và vừa để lưu mẫu trong quá trình giám định cần kiểm tra lại. Căn cứ vào tài liệu tham khảo thì trong luận văn này chúng tơi tính lượng máu chiết 1 ml để tối ưu nhất với lượng máu thu được trong công tác giám định. Thêm 10μl dung dịch THC-COOH 200 ng/ml và 10 μl dung dịch THC-COOH-d3 nồng độ 200 ng/ml vào 1 ml huyết tương để đạt nồng độ THC-COOH và THC-COOH-d3 ở 100 ng/ml dùng quá trình khảo sát.
Đánh giá độ thu hồi bằng cách so sánh tỉ lệ diện tích peak của chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn được xử lý, chiết xuất và nội chuẩn thêm vào sau khi chiết với tỉ lệ diện tích peak của mẫu chuẩn và nội chuẩn không qua xử lý và chiết xuất.
Kết quả độ thu hồi giữa các tỉ lệ dung môi được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.3.
Bảng 3. 2. Độ thu hồi chất phân tích trong máu tại các tỉ lệ dung mơi khác nhau
TT Dung mơi STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Trung bình STHC-COOH/ STHC-COOH- d3 Trung bình So sánh
Hiệu suất thu hồi (%) 1 hexanee 0,254 0,339 75,1% 2 hexanee/ETA (9:1, v/v) 0,281 0,339 82,8% 3 hexanee/ ETA (8:2, v/v) 0,256 0,339 75,5% 4 hexanee/ ETA (7:3, v/v) 0,232 0,339 69,6% 5 hexanee/ ETA (6:4, v/v) 0,227 0,339 66,9% 6 hexanee/ ETA (5:5, v/v) 0,186 0,339 55,5%