trong máu
Sắc ký là phương pháp dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất vào hai pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa tan vào nhau là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc lớn và pha động chạy qua pha tĩnh. Pha tĩnh có thể là một chất rắn (hạt xốp hay mịn) hay một chất lỏng (được giữ trên một chất mang). Khi pha động là chất lỏng, phương pháp được gọi là phương pháp sắc kí lỏng (LC), tương tự khi pha động là chất khí, phương pháp được gọi là phương pháp sắc kí khí (GC).
1.3.1. Sắc kí khí khối phổ (GC-MS):
Việc phân tích THC-COOH trong máu phù hợp với khả năng của thiết bị sắc ký khí (GC) kết nối detector khối phổ (MS), vì thế kết quả phân tích có độ chính xác cao.
Nguyên tắc hoạt động của sắc ký khí: Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Trong sắc ký khí, mẫu được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này.
khí - rắn (GSC). Khi pha lỏng được gắn lên bề mặt của chất mang trơ hoặc được phủ dưới dạng một lớp phim mỏng lên thành cột mao quản, thì kỹ thuật này gọi là sắc ký khí -lỏng (GLC) [12, 13, 14].
Sắc ký khí là phương pháp có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, đối với những detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phương pháp có thể đạt 0,1 ng/ml.
Tuy nhiên, phương pháp có hạn chế là chỉ phù hợp với các hợp chất dễ bay hơi. Chính vì vậy, trước khi phân tích THC-COOH bằng GC, cần dẫn xuất nó để tạo hợp chất dễ bay hơi nhằm phù hợp với phương pháp [15].
Mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau, từ đó giới hạn phát hiện trong các nghiên cứu lại có sự khác nhau. Bảng 1.4 tóm tắt một số nghiên cứu sử dụng phương pháp sắc kí khí.
Bảng 1. 4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong máu bằng sắc ký khí
STT Chiết Dẫn xuất Thiết bị
phân tích Nội chuẩn
LOD (ng/ml) 1 [5] Pha rắn PFPA/PFPOH GC-MS THC- COOH-d9 0,87 2 [16] Pha lỏng hexane/etyla xetate (9:1) PFPA/PFPOH GC-MS THC- COOH-d3 0,5 3 [9] Pha rắn PFPA/PFPOH GC-MS THC- COOH-d3 1,0 1.3.2. Sắc kí lỏng khối phổ kép (LC-MS/MS)
Để phân tích THC-COOH trên thiết bị LC-MS/MS [17], các bước chuẩn bị, xử lý mẫu cũng tương tự như đối với sắc ký khí được trình bày trong mục 1.2.2 phía trên. Tuy nhiên đối với chất THC-COOH có phân tử lớn (344 g/mol) khả năng bay hơi kém nên dùng phương pháp này, chúng ta không cần thực hiện giai đoạn dẫn xuất mẫu. Vì với thiết bị LC-MS/MS có thể phân tích được cả
Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách chất dựa trên cả hiện tượng vật lý và hóa học. Trong quá trình sắc ký, trong cột sắc ký luôn xảy ra cân bằng động giữa pha tĩnh và pha động, nghĩa là sự vận chuyển và phân bố chất tan luôn được lặp đi lặp lại giữa hai pha. Chất phân tích được di chuyển từng lớp qua pha tĩnh từ đầu đến cuối cột sắc ký theo pha động với dòng chảy liên tục, tốc độ và thành phần nhất định, hay gradient. Do tính chất và cấu trúc của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ di chuyển của mỗi chất cũng khác nhau. Khi ở trong pha động, nó dịch chuyển theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại bị pha tĩnh giữ lại trong một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của mỗi chất tan, đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu giữ lâu, có chất tan bị lưu giữ ít trên cột. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.
Tùy theo tính chất và hàm lượng chất phân tích, trong sắc ký lỏng người ta đưa ra một số phương pháp cơ bản sau:
- Sắc ký lỏng pha thường (NP-HPLC). - Sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC). - Sắc ký trao đổi ion.
- Sắc ký rây phân tử. - Sắc ký ái lực.
Mỗi phương pháp có đặc điểm riêng về pha tĩnh và pha động, detector cũng như cách vận hành [15, 18, 19].
Một số nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong máu bằng sắc kí lỏng đã được công bố:
Bảng 1. 5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong máu bằng sắc ký lỏng
STT Chiết Thiết bị
phân tích Nội chuẩn
LOD (ng/ml) 1 [19] Pha rắn LC-MS/MS THC-COOH-d3 0,5 2 [9] Pha lỏng hexanee/etylaxetatee (9:1) LC-MS/MS THC-COOH-d3 1,0
Việc phân tích THC-COOH trong máu phù hợp với khả năng của thiết bị sắc ký khí (LC) kết nối detector khối phổ (MS), vì thế kết quả phân tích có độ chính xác cao.
Nguyên tắc hoạt động của sắc kí lỏng khối phổ kép: Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.
Trong sắc ký lỏng, mẫu được đưa vào qua kim phun của máy sắc ký lỏng, được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này. Khi pha tĩnh dùng trực tiếp silicagen ta có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực, pha động là các dung môi không phân cực thì gọi là sắc ký pha thường. Khi pha tĩnh là silicagen có gắn gốc ankyl mạch dài không phân cực còn pha động phân cực thì gọi là sắc ký pha đảo. Theo điều tra cho thấy khoảng 61% sử dụng sắc ký pha đảo để tách các chất có độ phân cực rấ đa dạng, từ rất phân cực, ít phân cực, tới không phân cực [9, 19]. Pha động làm việc trong điều kiện gradient nhị nguyên, có thể được sử dụng để tăng tốc hoặc làm chậm quá trình rửa giải một số chất phân tích ra khỏi cột trước khi chuyển vào máy dò là một khối phổ kế.
Khi đã ở trong khối phổ kế, các hợp chất bị ion hóa bởi quá trình ion hóa. Trong đề tài này, phương pháp ion hóa được sử dụng là ion hóa tia điện (ESI). ESI ở áp suất khí quyển và là một kỹ thuật ion hóa mềm, do đó phân tử
mao dẫn, các phân tử có mặt và tạo thành các ion dương hoặc âm. Vì mao quản và các ion có cùng điện tích, điều này khiến chúng đẩy lùi từ từ lẫn nhau, và các ion di chuyển về phía điện cực ngược dấu với điện tích trái dấu. Như vậy, chất lỏng tích điện thoát ra khỏi đầu ống mao dẫn, sức căng bề mặt chất lỏng trong thời gian ngắn tạo thành hình nón (hình nón Taylor) trước khi các giọt tách ra khỏi nhau thành một tia phun dưới dạng giọt lớn và được sự trợ giúp của khí nitơ và nhiệt độ cao, sau bay hơi dần thành giọt nhỏ dần. Khi các giọt nhỏ lại, điện tích trên bền mặt tăng lên cho đến khi nó đạt đến giới hạn, và khi các ion đẩy ngày càng gần nhau, xảy ra sự va chạm và các giọt cuối cùng bị khử thành các phân tử tích điện đơn. Các phân tử tích điện này sau đó được tăng tốc vào máy phân tích khối lượng.
Trong phép đo khối phổ song song (MS / MS) có nhiều máy phân tích khối lượng trong dụng cụ. Trong bộ ba tứ cực (QQQ), có ba bộ phân tích khối lượng tứ cực, sắp xếp tuần tự. Trong QQQ, tứ cực thứ nhất và thứ ba hoạt động như bộ lọc khối lượng bình thường. Trong ghi tín hiệu khối phổ (MRM), bộ lọc tứ cực đầu tiên có chọn lọc các ion mẹ, tứ cực thứ hai phân mảnh các ion mẹ thành các ion con và tứ cực thứ ba lọc chọn lọc các ion con. Khi các ion đi qua các thiết bị phân tích khối lượng này, chúng sẽ được cảm biến bởi máy dò, khuếch đại và gửi tín hiệu đến máy tính để phân tích phổ.
Phương pháp này khắc phục những hạn chế của sắc kí khí là chỉ phù hợp với các hợp chất dễ bay hơi nên trước khi phân tích THC-COOH bằng GC, cần dẫn xuất nó để tạo hợp chất dễ bay hơi. Sử dụng sắc ký lỏng khối phổ kép ta bỏ qua bước dẫn xuất, vừa kinh tế và hiệu quả [9].
Hình 1. 4. Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ
- Phương pháp phân tích định tính:
Nguyên tắc của các phép phân tích định tính là dựa vào một yếu tố đặc trưng của tín hiệu tương ứng với mỗi cấu tử để nhận diện chúng. Trong sắc lỏng người ta sử dụng yếu tố đặc trưng là thời gian lưu để nhận diện các cấu tử bằng cách so sánh thời gian lưu của chúng với thời gian lưu của chất chuẩn. Sử dụng phương pháp LC/MS/MS, ngoài việc nhận diện các cấu tử thông qua yếu tố thời gian lưu, chất cần phân tích còn được nhận diện dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng. Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa,.. Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [20, 21].
- Phương pháp phân tích định lượng:
Trong sắc kí, hai phương pháp thường được sử dụng để định lượng chất phân tích là phương pháp nội chuẩn và phương pháp ngoại chuẩn.
Phương pháp nội chuẩn dựa trên sự so sánh cường độ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn. Các chất dùng làm chất nội chuẩn là các chất không có trong thành phần của mẫu, cho tín hiệu ổn định và khoảng thời gian lưu nằm gần khoảng thời gian lưu của chất
biết. Khi tính toán máy sẽ dựa vào tỉ lệ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn để tính ra nồng độ. Phương pháp này có độ chính xác cao vì nó loại bỏ được các yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu phân tích (yếu tố nền, sự sai khác về thể tích bơm mẫu giữa các lần đo).
Nguyên tắc của phương pháp ngoại chuẩn là so sánh trực tiếp độ lớn của các tín hiệu (diện tích hay chiều cao peak thu được) trong mẫu chưa biết với dung dịch chuẩn của chất đó. Trước tiên cần bơm dung dịch chuẩn của chất cần phân tích với các nồng độ thích hợp. Từ các kết quả thu được ta xây dựng đường chuẩn có dạng: y = a + bx. Đo diện tích (hoặc chiều cao) peak của chất cần phân tích (giá trị y) và áp vào đường chuẩn ta có thể tính ra nồng độ cấu tử cần phân tích (giá trị x).
Với thiết bị phân tích hiện đại LC-MS/MS phân tích mẫu theo chế độ MRM với ion hóa mẫu âm cho kết quả phân tích nhanh, có độ ổn định, chính xác và độ nhạy cao, lượng mẫu dùng trong phân tích nhỏ nên chúng tôi dùng phương pháp nội chuẩn để phân tích định lượng [14, 19].
1.4. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH
Phân mảnh của THC-COOH sau khi sử dụng chế độ nguồn Ion hóa ESI (-) [M-H]- và sử dụng kỹ thuật ghi phổ MRM có các phân mảnh m/z = 343; 299; 245; 191 được thể hiện như sau [22]:
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Để xác định THC-COOH trong máu, cần khảo sát các điều kiện môi trường pH để chiết lỏng - lỏng, dung môi chiết, hiệu suất chiết, và điều kiện trước khi đưa vào phân tích bằng máy LC-MS/MS.
Phân tích hàm lượng THC-COOH trong máu bằng quy trình đã lựa chọn được trên LC-MS/MS.
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu máu nghi sử dụng cần sa. Các mẫu máu đều được thử phản ứng miễn dịch với kít thử cần sa.
2.1.3. Mẫu nghiên cứu
Huyết tương là một trong hai thành phần chính của mô máu, là dịch chứa các thành phần vô hình và hòa tan rất nhiều protein, hormone và các chất khác, hay huyết tương bao gồm huyết thanh và các yếu tố đông máu.
Luận văn sử dụng mẫu huyết tương người để xây dựng quy trình phân tích khảo sát và đánh giá phương pháp phân tích THC-COOH.
2.1.4. Nội dung nghiên cứu
Sau khi chiết THC-COOH, tiến hành bơm dung dịch này để phân tích trên LC-MS/MS. Cùng với sự kế thừa các nghiên cứu về phân tích THC- COOH, để xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong máu bằng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ kép, trong luận văn này các vấn đề sau đây được nghiên cứu:
- Khảo sát dung môi chiết.
- Khảo sát môi trường chiết (pH). - Đánh giá hiệu quả chiết.
- Xây dựng đường chuẩn định lượng của THC-COOH.
- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) - Đánh giá tính phù hợp của phương pháp: Độ lệch chuẩn tương đối, hiệu
suất thu hồi…
- Ứng dụng: Phân tích trên các mẫu máu của người nghi sử dụng Cần sa bị bắt giữ.
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Mẫu chuẩn THC-COOH 0,1 mg/ml, THC-COOH-d3 1 mg/ml Arlesheim, Thụy Sỹ do Liên hợp quốc cấp với lượng chính xác là 0,1 mg.
- Các hóa chất còn lại đều là hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (đạt tiêu chuẩn PA):
+ Axit TCA tinh khiết 99%. + Muối Amoniacetat
+ Muối khan Na2SO4 (Merck, Đức) được nung ở 2500C trong 2h trước khi sử dụng.
+ Nước cất hai lần.
+ Khí N2 kỹ thuật 99% dùng để đuổi dung môi.
+ Các dung môi tinh khiết: Etylaxetat, methanol, hexanee (Merck, Đức). + Kít thử miễn dịch Acon, Mỹ.
- Cách pha dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc, các dung dịch chuẩn ở nồng độ khác nhau, dung dịch nội chuẩn như sau:
+ Pha các dung dịch chuẩn và dung dịch axit TCA * Pha dung dịch chuẩn gốc 5 µg/ml:
Dung dịch chuẩn gốc nồng độ 5 µg/ml được chuẩn bị như sau: Hút 0,5ml dung dịch chuẩn 100 µg/ml vào bình định mức, sau đó dùng CH3OH định mức đến 10ml, được nồng độ 5 µg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở 2 - 4oC
* Pha dung dịch chuẩn làm việc 0,5 µg/ml:
Hút 1ml dung dịch chuẩn gốc 5 µg/ml vào bình định mức, sau đó dùng CH3OH định mức đến 10ml, được nồng độ 0,5 µg/ml. Dung dịch chuẩn làm việc được bảo quản ở 2 - 4oC.
* Pha dung dịch chuẩn kiểm tra 0,1 µg/ml:
Hút 0,01ml (10 µl) dung dịch chuẩn 100 µg/ml vào bình định mức, sau đó sau đó dùng CH3OH định mức đến 10 ml, được nồng độ 0,1 µg/ml. Dung dịch chuẩn kiểm tra được bảo quản ở 2 - 4oC.
* Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc 5; 10; 25; 50; 100; 400 ng/ml: được pha từ dung dịch chuẩn làm việc trong dung môi là methanol hoặc pha trong nền mẫu trắng. Các dung dịch này chỉ pha khi sử dụng.
+ Pha dung dịch nội chuẩn:
* Pha dung dịch nội chuẩn gốc 1000 ng/ml: Hút 0,1 ml dung dịch nội