Sau hơn 20 năm cơng cuộc phịng, chống HIV/AIDS tại Việt Nam, từ những phịng thí nghiệm HIV được thành lập đầu tiên tại Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh vào năm 1988, đến năm 1990 trường hợp nhiễm HIV đầu tiên tại Việt Nam được phát hiện tại thành phố Hồ Chí Minh đánh dấu cho sự hình thành và phát triển mạng lưới các phịng thí nghiệm phục vụ công tác phịng, chống HIV/AIDS trên tồn quốc.
Cho đến nay, hệ thống phịng thí nghiệm HIV đã được thiết lập với hơn 1.100 phòng, trong đó có 92 phịng thí nghiệm khẳng định HIV tại 58 tỉnh, 04 phịng thí nghiệm tham chiếu theo khu vực, 485 phòng tư vấn xét nghiệm tự nguyện HIV trong cả nước [3]. Bên cạnh đó hệ thống xét nghiệm hỗ trợ theo dõi điều trị HIV/AIDS hình thành từ năm 2006 và mở rộng ra 56 cơ sở xét nghiệm tại 36 tỉnh/thành phố với 42 cơ sở hoạt động liên tục, 06 cơ sở xét nghiệm đo tải lượng vi rút HIV và 02 cơ sở xét nghiệm chẩn đoán sớm nhiễm HIV cho trẻ dưới 18 tháng tuổi và xét nghiệm định gen kháng thuốc HIV, riêng 02 phịng thí nghiệm định gen kháng thuốc đạt tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới. Trong số hơn 1100 cơ sở xét nghiệm HIV, đã có 06 cơ sở xét nghiệm khẳng định HIV đạt tiêu chuẩn ISO 15189: Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, Khoa Vi sinh Bệnh viện Bạch Mai, Phịng thí nghiệm HIV của Trung tâm Y tế dự phịng TP. Hồ Chí Minh, Viện Pasteur Nha Trang, Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Trung ương.
Công tác quản lý đảm bảo chất lượng xét nghiệm cũng đã được quan tâm triển khai và thực hiện ở tất cả các cơ sở xét nghiệm chuyên sâu, tuy nhiên phần lớn phụ thuộc vào chương trình ngoại kiểm của các nước trên thế giới và trong khu vực. Chưa thống nhất một đơn vị quản lý và đảm bảo chất lượng xét nghiệm phục vụ hoạt động phòng, chống HIV/AIDS cấp độ quốc gia. Việt Nam chỉ cung cấp được chương trình ngoại kiểm về huyết thanh học HIV đáp ứng 100% cơ sở xét nghiệm khẳng định HIV, 37,8% cơ sở xét nghiệm sàng lọc HIV.
Công tác quản lý, đánh giá chất lượng sinh phẩm xét nghiệm còn hạn chế, chưa xây dựng được phương cách xét nghiệm tại Việt Nam. Trang thiết bị xét
nghiệm q cũ và lạc hậu khơng cịn phù hợp với sự phát triển của các công nghệ xét nghiệm. Các chính sách quốc gia về xét nghiệm chưa cập nhật được với tiến bộ khoa học kỹ thuật của thế giới. Nguồn lực cho cơng tác xét nghiệm cịn thiếu, cán bộ xét nghiệm cịn thiếu và yếu về chun mơn chưa đồng đều giữa các tuyến, các khu vực.
Mạng lưới xét nghiệm đã được hình thành và bao phủ trên toàn quốc nhưng chưa đồng bộ và đồng đều giữa các vùng miền, hệ thống tham chiếu quốc gia mới đang từng bước hình thành và củng cố chất lượng tiến tới việc ứng dụng các kỹ thuật chuyên sâu; Các kỹ thuật chuyên sâu chỉ tập trung tại một số đơn vị trọng điểm do đó cũng có những khó khăn tồn tại nhất định trong việc tiếp cận với dịch vụ xét nghiệm [8].
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. ĐỐI TƯỢNG
Mẫu huyết tương dương tính với kháng thể kháng vi rút HIV: Là mẫu có chứa kháng thể kháng vi rút HIV được chẩn đoán theo phương cách III của Bộ Y tế. Mẫu huyết tương này có phản ứng dương tính với cả 3 loại sinh phẩm có ngun lý hoặc chuẩn bị kháng nguyên khác nhau.
Mẫu huyết tương âm tính với kháng thể kháng vi rút HIV: Là mẫu không chứa kháng thể kháng vi rút HIV. Mẫu huyết tương này được xét nghiệm với sinh phẩm xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng HIV cho kết quả âm tính.
Các mẫu huyết tương sử dụng cho chương trình ngoại kiểm thường có thể tích lớn. Do đó những mẫu này được thu thập từ các ngân hàng máu của Viện Huyết học Truyền máu trung ương, Khoa huyết học của các Bệnh viện đóng trên địa bàn Hà Nội như bệnh viện Viêt Đức, bệnh viện 108-Bộ Quốc phịng, bệnh viện 198-Bộ Cơng An....
Tiêu chuẩn nhận mẫu:
+ Mẫu có chất lượng tốt, khơng tán huyết, đơng vón.
+ Thời gian bảo quản 1 tuần/2-8oC, hoặc âm sâu từ <-20oC. + Nhiệt độ vận chuyển 2-8oC (hoặc < -2oC với mẫu cấp đông).
Tiêu chuẩn loại bỏ mẫu: mẫu bị loại nếu một trong các tiêu chuẩn trên không đạt
yêu cầu.
Bộ mẫu chuẩn xây dựng gồm 10 mẫu: 6 mẫu âm tính, 4 mẫu dương tính trong đó có 2 mẫu pha lỗng giống hệt nhau.
2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ HĨA CHẤT
Bảng 1: Máy móc và thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Hãng sản xuất Nước sản xuất
Máy ly tâm tốc độ cao Hettich Đức
Tủ ấm Memmert Đức
Tủ lạnh thường Sanyo Nhật Bản
Tủ lạnh âm sâu Sanyo Nhật Bản
Máy khuấy từ Daigger Hoa Kỳ
Tủ an toàn sinh học ESCO Tây Ban Nha
Tủ ổn nhiệt Jeiotech Hàn Quốc
Bơm hút chân không Millipore Mỹ
Pipet Aids Finn pipette Hoa Kỳ
Hệ thống Elisa Bio Rad Hoa Kỳ
Pipetman Thermo scientific Hoa Kỳ
Repeat pipette Eppendorf Hoa Kỳ
Máy lắc ngang Taitec Nhật Bản
Máy lắc Auto Blot 3000 Medtec Hoa Kỳ
Máy in nhãn Zebranet Hoa Kỳ
Dụng cụ và vật tư tiêu hao sử dụng cho nghiên cứu được liệt kê ở Bảng 2
Bảng 2: Dụng cụ và vật tư tiêu hao
Tên dụng cụ Hãng sản xuất Nước sản xuất
Ống cryo Greiner Đức
Ống Fancol 15; 50ml Corning Hoa Kỳ
Đầu côn Eppendorf Hoa Kỳ
Nhãn in ống nghiệm Forever Đài Loan
Thanh khuấy từ kích thước 1; 2; 3 cm Shanxi Trung Quốc
Chai đựng mẫu vuông Nalgene Hoa Kỳ
Panh, kéo Everbest Pakistan
Giấy thiếc Las Palms Việt Nam
Hộp các tông đựng mẫu Việt Nam
Màng lọc Nalgene Hoa Kỳ
Hóa chất, sinh phẩm sử dụng trong đề tài được liệt kê trong Bảng 3
Bảng 3:: Hóa chất sử dụng
Tên hóa chất Hãng sản xuất Nước sản xuất
Genscreen HIV 1/2 Version 2 Bio Rad Hoa Kỳ
Genscreen Ultra HIV Ag/Ab Bio Rad Hoa Kỳ
Murex HIV Ag/Ab Combination Diasorin Anh
SD HIV 1/2 Elisa 3.0 Standard
Dianostics
Hàn Quốc
Serodia HIV 1/2 Mix Fujirebio Nhật Bản
Determine HIV 1/2 Alere Nhật Bản
Q Spot HIV 1/2 Phamatech Hoa Kỳ
SD Bioline HIV 1/2 3.0 Standard Dianostics
Hàn Quốc
Acon HIV 1/2 ACON
Laboratories
Hoa Kỳ
Double Checkgold HIV 1/2 Alere Israel
New lab Blot I Bio Rad Hoa Kỳ
Thrombin Sigma Hoa Kỳ
Proclin 300 Supelco Hoa Kỳ
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu được áp dụng theo khuyến cáo của Tổ chức Y tế thế giới, UNAIDS và của Phịng thí nghiệm chuẩn thức HIV, Viện sức khỏe Quốc gia Thái Lan [28, 63].
2.3.1 Xây dựng bộ mẫu chuẩn EQAS
Bộ mẫu ngoại kiểm EQAS gồm 10 mẫu được sản xuất từ các mẫu huyết thanh được khẳng định là dương tính và âm tính với HIV. Số lượng mẫu trong bộ mẫu chuẩn có thể thay đổi tùy thuộc vào mục đích và chất lượng các đơn vị tham gia, tuy nhiên thường khơng ít hơn 3 mẫu [9]. Các loại mẫu là huyết tương sẽ được chuyển đổi thành huyết thanh.
- Số mẫu huyết thanh dương tính cũng thay đổi tùy thuộc vào số mẫu chuẩn của bộ mẫu, trong nghiên cứu này chúng tôi thiết kế bộ mẫu chuẩn là 10 vì vậy mẫu dương tính sẽ là: 4 mẫu, trong đó có 02 mẫu pha lỗng giống hệt nhau để kiểm tra độ chính xác trong xét nghiệm chẩn đốn HIV của một phịng thí nghiệm
- Số mẫu huyết thanh âm: 6 mẫu
2.3.2 Xác định đặc tính của mẫu chuẩn
Các mẫu được xét nghiệm để xác định đặc tính về kháng thể kháng HIV bằng nhiều loại sinh phẩm khác nhau. Các sinh phẩm sử dụng để xác định đặc tính là các sinh phẩm được sử dụng phổ biến tại các phịng thí nghiệm.
Một số mẫu huyết thanh dương tính được pha lỗng bậc hai với các nồng độ khác nhau. Xác định nồng độ pha lỗng tối ưu cho kết quả dương tính với kháng thể HIV ở các loại sinh phẩm được sử dụng.
Xác định đặc tính mẫu thơng qua kỹ thuật Elisa thế hệ 3
Chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Elisa thế hệ thứ ba như Genscreen HIV 1/2 Version 2 của hãng Bio Rad; sinh phẩm SD HIV 1/ 2 Elisa 3.0 của hãng Standard Diagnostics.
Nguyên tắc :
- Là kỹ thuật Elisa “Sandwich” với 2 giai đoạn.
- Sử dụng giếng microplate có gắn kháng nguyên tinh chế là các protein tái tổ hợp.
- Kháng thể kháng HIV trong mẫu thử sẽ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng và được phát hiện bởi cộng hợp là các kháng nguyên virus gắn enzyme. Giá trị mật độ quang của phản ứng màu (OD) tỷ lệ thuận với lượng kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử [11, 34].
Xác định đặc tính mẫu thơng qua kỹ thuật Elisa thế hệ 4
Chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Genscreen Ultra HIV Ag/Ab của hãng Bio rad và Murex HIV Ag/Ab Combination của hãng Diasorin. Với sinh phẩm Elisa thế hệ thứ tư này chúng tôi mong muốn sẽ phát hiện sớm các trường hợp mới nhiễm trong giai đoạn cửa sổ.
Nguyên tắc: Kháng nguyên p24 hoặc các kháng thể kháng HIV hiện diện trong mẫu thử kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng p24 và các kháng nguyên vi rút được gắn trên giá đỡ. Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ được phát hiện bởi các cộng hợp gắn men cho phản ứng hiện màu sau khi cho cơ chất [11, 54].
Xác định đặc tính mẫu thơng qua kỹ thuật ngưng kết hạt
Chúng tôi sử dụng bộ sinh phẩm Serodia HIV 1/2 Mix của hãng Fujirebio Nhật Bản.
Nguyên tắc: Những hạt gelatin được gắn với các thành phần kháng nguyên của vi rút HIV sẽ tạo ngưng kết khi có sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh hoặc huyết tương.
Trong phản ứng ngưng kết, mẫu thử được tiến hành đồng thời trên hai giếng: với hạt gelatin không gắn kháng nguyên (giếng chứng âm) và các hạt gelatin có gắn kháng nguyên vi rút HIV 1 và HIV 2.
Khơng có phản ứng ngưng kết khi các hạt gelatin tự động lắng xuống thành hình nút nhỏ dưới đáy giếng.
Có phản ứng ngưng kết khi các hạt gelatin kết hợp tạo thành mạng liên kết phủ đều trên giếng.
Đọc và biện luận kết quả:
Điều kiện để đọc kết quả: Khơng có sự ngưng kết ở các giếng chứng âm. Trong trường hợp có hiện tượng ngưng kết ở các giếng chứng âm phải xử lý huyết thanh bằng cách hấp phụ các yếu tố làm ngưng kết không đặc hiệu trong huyết thanh và
Đọc kết quả:
o Mẫu âm tính: Khơng có sự ngưng kết ở cả hai giếng: giếng chứng âm và giếng phản ứng.
o Mẫu nghi ngờ: Khơng có sự ngưng kết ở giếng chứng âm, có sự ngưng kết không rõ ràng ở giếng phản ứng.
o Mẫu dương tính: Khơng có sự ngưng kết ở giếng chứng âm, có sự ngưng kết rõ ràng ở giếng phản ứng [11, 72].
Xác định đặc tính mẫu thơng qua kỹ thuật xét nghiệm nhanh
Chúng tôi sử dụng các sinh phẩm Determine HIV 1/2 của hãng Alere; sinh phẩm SD Bioline HIV 1/2 3.0 của hãng Standard Diagnostics; sinh phẩm Double Check gol HIV 1/2 của hãng Alere; sinh phẩm Acon của hãng Acon; sinh phẩm Q Spot HIV 1/2 của hãng Phamatech.
Nguyên tắc: Mẫu thử được nhỏ vào vùng nhỏ mẫu, sau khi nhỏ lượng huyết thanh hoặc huyết tương sẽ mao dẫn đi lên qua vùng cộng hợp. Vùng cộng hợp được gắn các kháng nguyên vi rút HIV 1/2 gắn hạt mầu Selenium colloid, có thể màu đỏ hoặc vàng. Hỗn hợp này tiếp tục dịch chuyển theo màng lên phía trên đi qua vị trí có gắn các kháng ngun vi rút là các peptit tái tổ hợp. Trong mẫu thử có các kháng thể kháng vi rút HIV đặc hiệu sẽ cho phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể và cộng hợp và xuất hiện một vạch màu tại vùng thử nghiệm. Hỗn hợp tiếp tục dịch chuyển lên vùng kiểm chứng mang theo các cộng hợp có gắn kháng nguyên và sẽ cho phản ứng với các kháng thể đơn dòng kháng HIV 1/2 được cố định sẵn ở vị trí kiểm chứng và tạo thành vạch màu tại vùng này.
Đọc kết quả:
o Dương tính: Mẫu thử có vạch màu ở cả vùng mẫu thử và vùng kiểm chứng.
o Âm tính: Chỉ có vạch tại vùng kiểm chứng, khơng có vạch ở vùng mẫu thử.
o Khi khơng có vạch màu ở vùng kiểm chứng cần tiến hành lại phản ứng đồng thời kiểm tra chất lượng sinh phẩm [11, 65, 72, 73].
Xác định đặc tính mẫu thơng qua kỹ thuật Western Blot
Xét nghiệm khẳng định Western-blot được chỉ định khi đã có kết quả dương tính với sinh phẩm sàng lọc. Tuy nhiên trong việc xác định đặc tính mẫu chuẩn cho bộ mẫu ngoại kiểm, chúng tôi sử dụng hai sinh phẩm sàng lọc nếu kết quả dương tính với cả hai sinh phẩm sẽ được xét nghiệm khẳng định bằng sinh phẩm Western- Blot. Trường hợp cả ba kỹ thuật này dương tính thì được coi là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán các trường hợp HIV.
Nguyên tắc: là một kỹ thuật theo nguyên lý ELISA gián tiếp thực hiện trên băng giấy đã cố định các thành phần kháng nguyên của vi rút ở những vị trí tương ứng theo trọng lượng phân tử. Kỹ thuật Western-blot cho phép xác định kháng thể kháng từng thành phần khác nhau của protein vi rút. Có Western-blot riêng cho HIV-1 và HIV-2.
Ủ huyết thanh của mẫu thử với băng giấy. Nếu trong mẫu thử có các kháng thể kháng HIV thì chúng sẽ gắn đặc hiệu lên các protein là kháng nguyên tương ứng và được phát hiện bằng cộng hợp là kháng thể kháng Immunoglobuline người đánh dấu bằng enzyme cho phản ứng màu với cơ chất.
Vị trí các băng màu tương ứng với kháng thể đặc hiệu với thành phần protein vi rút tương ứng [11].
2.3.3 Kỹ thuật chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh
Hiện nay các phịng thí nghiệm HIV thực hiện việc xét nghiệm phát hiện dựa trên các mẫu huyết thanh thu thập từ khách hàng. Tuy nhiên các mẫu do ngân hàng máu từ các trung tâm truyền máu thu thập là mẫu huyết tương. Vì vậy các mẫu huyết tương này được chuyển đổi thành huyết thanh bằng phương pháp Thrombin hóa hoặc phục hồi lại Canxi.
Kỹ thuật Thrombin hóa
- Lọ Thrombin 9,43mg 236 NIH units/mgpr; T4648-1KU025 được cho thêm 2ml nước cất tiệt trùng để đảm bảo nồng độ 500 đơn vị/ml hay 0,5 đơn vị/µl. Lắc đều để đạt nồng độ Thrombin đồng nhất.
- Cho Thrombin vào chai huyết tương với thể tích 0,1 µl Thrombin đã hồi chỉnh/ 1ml huyết tương.
- Lắc nhẹ nhàng bằng tay trong 1 phút.
- Ủ tại bể ổn nhiệt với nhiệt độ 37oC trong vòng 1-2 giờ. Sau khi ủ 1 giờ cần kiểm tra việc tạo cục tơ huyết.
- Khi cục tơ huyết đã tạo thành mang chai mẫu ra nhiệt độ phòng chờ 1 giờ rồi cho vào tủ âm sâu tối thiểu âm 20oC, để qua đêm 2-3 ngày.
- Rã đông tự nhiên tại nhiệt độ phòng, phần dịch nổi thu được chính là huyết thanh.
Phương pháp phục hồi lại Canxi
- Pha dung dịch CaCl2.2H2O 2Mol/l bằng cách cho 3g CaCl2.2H2O vào 10ml dung dịch nước cất.
- Cho 0,5ml dung dịch CaCl2 mới pha vào 100ml huyết tương, trộn đều và ủ ở bể ổn nhiệt trong 37oC trong 1-2 giờ (nồng độ pha loãng cuối cùng đạt 0,01 CaCl2). - Nếu huyết tương khơng tạo thành cục tơ huyết, có thể cho thêm CaCl2 nhưng không vượt quá 1% của dung dịch 2mol/lít và phải ủ lâu hơn.
- Khi cục tơ huyết đã tạo thành mang chai mẫu ra nhiệt độ phòng chờ 1 giờ rồi cho vào tủ âm sâu tối thiểu âm 20oC qua đêm.
- Sau khi qua đêm tại nhiệt độ âm sâu, ngày hôm sau rã đông tự nhiên tại nhiệt