3.4.3. Độ ổn định của bộ mẫu ngoại kiểm
Khi gửi cho 398 phịng thí nghiệm, bộ mẫu được gửi cho 10 đơn vị xa nhất để đánh giá độ ổn đinh. Kết quả độ ổn định của mẫu sau khi gửi đến đơn vị và được gửi trở lại Viện VSDTTƯ để làm xét nghiệm (Bảng 14).
Bảng 14: Độ ổn định của bộ mẫu gửi đến 398 đơn vị
TT Mã P XN D1 D2 Mean D1 D2 M ean D1 D2 Mean D1 D2 Mean
1 A 12.00 11.95 11.97 12.86 13.16 13.01 0.43 0.46 0.45 0.45 0.56 0.51 2 B 12.01 12.11 12.06 12.07 12.03 12.05 0.32 0.39 0.36 0.53 0.41 0.47 3 C 12.30 12.07 12.19 12.56 12.97 12.76 0.57 0.50 0.54 0.60 0.68 0.64 4 D 13.21 12.72 12.97 12.26 12.26 12.26 0.39 0.32 0.36 0.49 0.49 0.49 5 E 11.46 11.18 11.32 13.08 12.93 13.01 0.50 0.54 0.52 0.68 0.45 0.56 6 F 11.89 12.65 12.27 12.86 12.48 12.67 0.48 0.57 0.53 0.45 0.38 0.42 7 G 12.50 12.39 12.45 12.63 12.05 12.34 0.61 0.68 0.64 0.75 0.64 0.70 8 H 12.29 12.86 12.58 11.99 12.33 12.16 0.71 0.71 0.71 0.41 0.60 0.51 9 I 12.00 12.02 12.01 12.07 12.41 12.24 0.50 0.43 0.46 0.64 0.53 0.58 10 J 12.50 12.20 12.35 12.52 12.97 12.74 0.64 0.57 0.61 0.60 0.53 0.56
P -value= 0.195 , t hat 'smo re th an P -value= 0.475 , that's mo re th an
Ghi chú Nếu giá trị P-value > 0.05 , Chất lượng của mẫu đủ độ ổn định Nếu P-value < 0.05 , Chất lượng của mẫu không đủ ổn định
Kết luận: P Critical (0.05) P Critical (0.05)
Mẫu đủ ổn định. Mẫu đủ ổn định.
Mẫu chuyển đi Mẫu ở 4oC t ại NIHE Mẫu chuyển đi M ẫu ở 4oC tại NIHE
P -value of t-test = 0.195 0.475
Mã số mẫu NIHE HIV 1201-02 NIHE HIV 1201-01
3.4.4. Sinh phẩm các đơn vị thực hiện
Đa số các đơn vị thực hiện xét nghiệm với sinh phẩm nhanh Determine HIV 1/2 (41.53%), đứng ở vị trí thứ hai là sinh phẩm ngưng kết hạt Serodia HIV 1/2 Mix (13.84%), Acon HIV1/2 (10.91%), Murex HIV Ag/Ab (7.82%) (Hình 21).
3.4.5. Kết quả thực hiện của đơn vị tham gia
Trong số 398 đơn vị thực hiện bộ mẫu có 322 đơn vị có kết quả hồn tồn phù hợp với kết quả của Viện VSDTTƯ chiếm 80,9%. 07 phịng thí nghiệm có kết quả khơng phù hợp và 69 phịng thí nghiệm có kết quả phù hợp với kết quả chuẩn tuy nhiên khơng đưa ra kết luận cho tình trạng mẫu (Bảng 15).
Bảng 15: Kết luận của các phịng thí nghiệm về kết quả của bộ mẫu chuẩn Số PXN (n=398) Tỉ lệ % Số PXN (n=398) Tỉ lệ %
Phịng thí nghiệm kết luận phù hợp 322 80,90
Phịng thí nghiệm kết luận khơng phù hợp 7 1,76 Phịng thí nghiệm không đưa ra kết luận về mẫu 69 17,34
Trong bộ mẫu có 2 mẫu pha lỗng và lặp lại, vì vậy nghiên cứu sử dụng phân tích Youden để đánh giá độ chính xác trong việc thực hiện kỹ thuật Elisa của các đơn vị thơng qua việc phân tích kết quả của hai mẫu pha lỗng này. Từ biểu đồ 8 ta thấy các kết quả của phịng thí nghiệm nằm ngồi đường giới hạn màu đỏ (tương ứng ngoài 3SD) và nằm ở vùng II, IV thì đơn vị có kết quả sai số hệ thống. Nếu kết quả nằm ngoài đường mẫu đỏ và thuộc vùng I, III thì đơn vị được coi có sai số ngẫu nhiên. Ta thấy có 2 phịng thí nghiệm có kết quả sai số hệ thống và 3 phịng thí nghiệm có kết quả sai số ngẫu nhiên đối với sinh phẩm Genscreen HIV 1/2 Version 2 (Hình 22).
3.5. BÀN LUẬN
Bộ mẫu chuẩn đánh giá chất lượng các phịng thí nghiệm bao gồm cả mẫu âm tính và dương tính. Mẫu dương tính được thu gom từ các ngân hàng máu bằng cách thu thập các mẫu huyết tương thu thập từ người cho máu. Sau khi thu thập về bịch huyết tương được xét nghiệm sàng lọc bằng sinh phẩm Elisa thế hệ thứ tư gồm phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể nếu kết quả dương tính thì mẫu huyết tương sẽ không được sử dụng cho mục đích truyền máu. Các bịch huyết tương này được các trung tâm huyết học chuyển cho Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để sử dụng cho sản xuất mẫu ngoại kiểm. Hiện nay các chương trình hiến máu tình nguyện đều tiến hành sang lọc trước khi lấy đủ đơn vị máu. Do đó các trường hợp sàng lọc nghi ngờ dương tính đều loại bỏ. Do đó mẫu dương tính sẽ rất hạn chế, khơng thường xun vì vậy đây cũng là một vấn đề khó khăn khi sản xuất.
Với thử nghiệm phục hồi Canxi tại các nồng độ khác nhau đã cho những kết quả khác nhau. Tại nồng độ 0,001M, 0,005M hầu như không tạo ra sợi tơ huyết. Với nồng độ đậm đặc hơn 0,05M và 0,1M lượng tơ huyết tạo thành cục đông cứng do đó lượng huyết thanh thu được khơng nhiều vì vậy mà nghiên cứu đã sử dụng nồng độ Canxi 0,01M. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Hàn Quốc, chính vì vậy hiện nay chương trình ngoại kiểm của Hàn Quốc cho xét nghiệm huyết thanh học HIV đã không chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh thông qua phương pháp phục hồi Canxi nữa [46]. Nồng độ này cũng phù hợp với các hướng dẫn của WHO [11, 71]. Từ kết quả thử nghiệm chuyển đổi huyết thanh từ huyết tương thông qua hai phương pháp phục hồi Canxi và Thrombin hóa cho thấy sự tạo cục tơ huyết giữa hai phương pháp có sự khác nhau. Với ống mẫu chuyển huyết tương thành huyết thanh theo phương pháp Thrombin: các ống mẫu trong, cục tơ huyết co rõ nét. Còn đối với ống mẫu phục hồi bằng Canxi cục tơ huyết tạo không thành cục rõ nét, tơ huyết thành từng cục nhỏ lẫn trong huyết thanh, tạo cho ống mẫu không trong mà đục, lượng tơ huyết tạo thành không nhiều. Bên cạnh đó các kết quả khơng xác định của mẫu âm tính đối với kỹ thuật ngưng kết hạt cũng gây khó khăn nếu lựa chọn phương pháp này để chuyển đổi huyết
Trong bộ mẫu cịn có mẫu dương tính yếu và việc thu thập mẫu có nồng độ kháng thể kháng HIV thấp là vơ cùng khó. Do đó nghiên cứu đã sử dụng phương pháp pha loãng mẫu. Trong trường hợp nếu đơn vị có kết quả sai lệch mà chúng ta khơng có kết quả đối chứng thì sẽ khó đánh giá kết quả sai của đơn vị vì mẫu khơng là mẫu gốc thuần chủng. Do đó việc pha lỗng mẫu ít được các nhà cung cấp mẫu ngoại kiểm lựa chọn [32, 37, 50, 71]. Tuy nhiên tùy vào yêu cầu, mục đích và điều kiện sản xuất mà một số phương pháp chuẩn bị mẫu như DBS, DPS hay mẫu pha loãng vẫn được áp dụng [22, 27, 32, 57, 59]. Hai mẫu trong bộ mẫu sản xuất có kết quả dương tính vừa phải với các kỹ thuật xét nghiệm nhanh còn với kỹ thuât Elisa thì vẫn có giá trị OD/CO cao. Tuy nhiên các đơn vị khi thực hiện xét nghiệm trên các mẫu này đánh giá mẫu thực hiện cịn gặp khó khăn trong biện luận với các sinh phẩm nhanh. Do đó cần cân nhắc việc sản xt mẫu cho các phịng thí nghiệm phù hợp. Tốt nhất những đơn vị sàng lọc nên có mẫu dương tính và âm tính rõ ràng, dễ đọc kết quả. Cịn các đơn vị là phịng thí nghiệm khẳng định thì cần có các mẫu khó để đánh giá năng lực. Do các phịng thí nghiệm khẳng định này phải chẩn đốn các trường hợp HIV dương tính nên địi hỏi các tiêu chuẩn ngặt nghèo hơn.
Mặc dù trong quá trình sản xuất các mẫu được xét nghiệm với rất nhiều sinh phẩm khác nhau tuy nhiên trong kết quả chuẩn tại phụ lục 2 để các đơn vị so sánh kết quả của mình với kết quả chuẩn nghiên cứu chỉ đưa vào 3 kỹ thuật theo đúng chiến lược III của Bộ Y tế [5]. Lý do là việc thực hiện với nhiều sinh phẩm giúp cho việc các kết quả phản hồi từ các đơn vị tham gia sau này nếu có trái ngược với kết quả của các sinh phẩm đã sử dụng trong kết quả chuẩn thì có thể đối chiếu với kết quả của cùng loại sinh phẩm mà nghiên cứu đã thực hiện khi sản xuất.
Hiện tai trên thị trường có hơn 30 loại sinh phẩm xét nghiệm phát hiện HIV đang lưu hành. Chính vì thế đây là khó khăn cho việc sản xuất, do khơng thể có hết tất cả các sinh phẩm đang lưu hành trên thị trường Việt Nam. Số lượng các phịng thí nghiệm sàng lọc tại Việt Nam chiếm hơn 1100 phòng và đa số các đơn vị sử dụng sinh phẩm nhanh nên nghiên cứu đã lựa chọn những sinh phẩm nhanh được đánh giá tốt bởi các tổ chức có uy tín để thực hiện. Nghiên cứu đã thực hiện trên 3
loại sinh phẩm Elisa trong đó có 01 sinh phẩm Elisa xét nghiệm phát hiện cả kháng nguyên và kháng thể, 6 loại sinh phẩm đơn giản, nhanh khác nhau và 01 sinh phẩm Western Blot. Việc lựa chọn các loại sinh phẩm với các nguyên lý khác nhau và số lượng lựa chọn đã đáp ứng được các hướng dẫn về sản xuất mẫu ngoại kiểm của Tổ chức Y tế thế giới. Điều này cũng tương đồng với các chương trình ngoại kiểm khác trên thế giới [22, 33, 71]. Trong trường hợp phịng thí nghiệm sử dụng những sinh phẩm mà trong quá trình sản xuất khơng thực hiện và các đơn vị tham gia khác cũng khơng sử dụng thì trong trường hợp kết quả của đơn vị tham gia sai sẽ rất khó khăn trong việc đánh giá, đưa ra ý kiến đóng góp chất lượng phịng thí nghiệm này. Việc kết quả khơng phù hợp đó sẽ khơng biết do chất lượng sinh phẩm hay do sai sót chun mơn trong q trình thực hiện.
Trong bảng kết quả của các đơn vị so với kết quả chuẩn có 7 đơn vị có kết quả sai lệch. Điều tra và tìm hiểu nguyên nhân của các kết quả không phù hợp cho thấy: 01 đơn vị chuyển kết quả từ biểu mẫu kết quả sang biểu mẫu tổng hợp sai, 01 đơn vị thực hiện nhầm mẫu và 05 đơn vị đọc kết quả khi chưa đủ thời gian. Theo quy định của nhà sản xuất mẫu phải chờ đủ 15 phút mới đọc kết quả tuy nhiên đơn vị đã đọc kết quả khi 10 phút hoặc khi vạch chứng xuất hiện. Việc thực hiện xét nghiệm đối với các xét nghiệm nhanh đặc biệt tại các phịng thí nghiệm tuyến xã, huyện cho các kết quả không phù hợp. Nguyên nhân do sự thiếu trang thiết bị, tập huấn và việc bảo quản sinh phẩm còn hạn chế cũng như việc xây dựng các quy trình chuẩn chưa có. Việc khơng tn thủ hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất được phản ánh rõ nét trong kết quả của chương trình ngoại kiểm. Điều này không chỉ xảy ra tại Việt Nam, một số báo cáo từ các nước cũng phản ánh sự khơng tn thủ quy trình của cán bộ phịng thí nghiệm [49]. Việc tuân thủ các quy trình chuẩn là hết sức quan trọng đối với hoạt động của một phịng thí nghiệm. Bên cạnh đó, để có được kết quả chính xác việc kiểm sốt các hóa chất, sinh phẩm cũng cần được quan tâm [32, 48]. Qua đây chúng ta thấy tầm quan trọng của việc giám sát đảm bảo chất lượng thông qua các bộ mẫu ngoại kiểm. Từ các sai sót trong việc thực hiện bộ mẫu chúng ta có thể thấy được các điểm chưa phù hợp tại đơn vị thực hiện. Ngồi ra các đơn vị
khơng mắc sai lầm nhưng thông qua kết quả của đơn vị khác cũng có thể tránh cho mình những nguy cơ tiềm ẩn để từ đó nâng cao được chất lượng xét nghiệm của đơn vị mình.
Từ bảng tổng hợp các sinh phẩm sử dụng của các đơn vị cho thấy các phòng thí nghiệm HIV hiện nay đang sử dụng lượng sinh phẩm ngưng kết hạt chiếm tỷ lệ lớn. Với việc chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh bằng phương pháp phục hồi Canxi đã cho kết quả xét nghiệm không rõ ràng ở 2 mẫu huyết thanh âm tính. Ngồi ra trong việc chuyển đổi huyết thanh với phương pháp Thrombin hóa cho ưu điểm: tạo cục tơ huyết rõ ràng, chất lượng huyết thanh trong, lượng huyết thanh sau khi tách khỏi tơ huyết nhiều. Ngược lại với phương pháp phục hồi Canxi: lượng tơ huyết tạo không chắc, rải rác trong huyết thanh, màu chuyết thanh chuyển đục, lượng huyết thanh sau khi tách khỏi sợi tơ huyết ít do lượng tơ huyết lơ lửng nhiều.Trong trường hợp nồng độ Canxi cao cục tơ huyết tạo thành đông cứng, lượng huyết thanh tạo ra ít [46]. Vì vậy, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp Thrombin hóa cho quy trình sản xuất mẫu ngoại kiểm tại Việt Nam.
Bộ mẫu chuẩn được sản xuất đã đạt được độ đồng nhất và ổn định, ở đây độ ổn định đã được đánh giá tại nhiệt độ phòng trong thời gian 50 ngày, kết quả dương tính và âm tính vẫn rõ ràng. Ngồi ra tại vịng thử nghiệm kết quả đánh giá F test và T test thỏa mãn cho thấy bộ mẫu đã đáp ứng được các yêu cầu cho một mẫu chuẩn đánh giá chất lượng phòng thí nghiệm về độ đồng nhất và độ ổn định. Ngoài ra, bộ mẫu được cho chất bảo quản nên gửi đến các đơn vị trong điều kiện thường, chất lượng mẫu không bị ảnh hưởng tạo nhiều thuận lợi và giảm chi phí khi vận chuyển. Điều này đã khắc phục được yếu điểm của việc phải bảo quản mẫu trong điều kiện lạnh hoặc bị ảnh hưởng bởi độ ẩm của mơi trường như một số chương trình ngoại kiểm khác [45, 59].
Việc thực hiện đảm bảo chất lượng xét nghiệm tại Việt Nam còn gặp nhiều khó khăn. Khái niệm đảm bảo chất lượng mới thực sự được quan tâm trong những năm gần đây. Tuy nhiên, để thực hiện được tốt công tác đảm bảo chất lượng địi hỏi một nguồn kinh phí thường xun và đủ lớn. Hiện nay, để chạy các mẫu ngoại kiểm
các đơn vị cũng phải dự trù sinh phẩm, dù bộ mẫu chỉ có 10 mẫu. Chúng tơi cũng gặp nhiều phản ánh về việc khơng có sinh phẩm để chạy mẫu ngoại kiểm này. Do đó trong bối cảnh kinh tế nước ta cịn nhiều khó khăn, việc nhập bộ mẫu đánh giá chất lượng phịng thí nghiệm từ bên ngồi chiếm một lượng kinh phí lớn mà nhiều đơn vị không thể chi trả được chưa kể tiền thuế hải quan và chi phí nhận mẫu từ sân bay về đến các phịng thí nghiệm.
Hiện tại việc xác định tình trạng các mẫu âm trong bộ mẫu ngoại kiểm sử dụng các xét nghiệm phát hiện kháng thể và xét nghiệm kết hợp kháng nguyên kháng thể (Cụ thể là sinh phẩm ELISA thế hệ thứ 4) đã phần nào rút ngắn được giai đoạn cửa sổ của mẫu (nếu có nhiễm). Phương pháp này giống như các phương pháp mà Phịng thí nghiệm chuẩn thức quốc gia HIV của Úc, Phịng thí nghiệm chuẩn thức quốc gia HIV Thái Lan đang làm từ nhiều năm nay. Tuy nhiên nếu các mẫu này được xét nghiệm trực tiếp như: phát hiện ARN; AND tiền vi rút thì sẽ tốt hơn.
Theo xu hướng chung của thế giới, việc mở rộng xét nghiệm đã không phải ưu tiên hàng đầu mà thay vào đó là chất lượng của các kết quả xét nghiệm. Với vai trò là đơn vị tuyến trung ương hỗ trợ kỹ thuật các đơn vị, chúng tôi thấy rằng việc sản xuất các mẫu chuẩn này nhằm nâng cao chất lượng xét nghiệm tại các phịng thí nghiệm huyết thanh học HIV là rất cần thiết và đáp ứng các yêu cầu của Bộ y tế.
Với kết quả đánh giá từ các đơn vị cũng như các đánh giá chất lượng mẫu tại phịng thí nghiệm cho thấy nghiên cứu đã đáp ứng được các tiêu chí cơ bản của bộ mẫu chuẩn. Các mẫu có chất lượng ổn định, đồng nhất, chi phí thấp. Với các kết quả này, bộ mẫu ngoại kiểm sẽ được ứng dụng rộng rãi, thúc đẩy công tác đảm bảo chất lượng xét nghiệm tại Việt Nam.
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thí nghiệm và phân tích trên đây, chúng tơi rút ra một số kết luận sau:
Hoàn thành việc xây dựng quy trình sản xuất mẫu chuẩn cho đánh giá chất lượng các phịng thí nghiệm huyết thanh học HIV.
Bộ mẫu chuẩn sản xuất để đánh giá chất lượng các phịng thí nghiệm huyết thanh học HIV đảm bảo chất lượng với độ ổn định, đồng nhất cao.