2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Đánh giá chất lượng mẫu sản xuất
2.3.4.1 Đánh giá độ đồng nhất
Sau khi các mẫu được xác định đặc tính mẫu phù hợp sẽ được đánh giá độ đồng nhất trước khi đóng gói chuyển đến các đơn vị. Nếu mẫu đánh giá không đạt độ đồng nhất sẽ bị loại bỏ [1, 71].
Với các mẫu pha loãng hoặc mẫu trộn, phải đánh giá độ đồng nhất để đảm bảo mẫu ở các ống nghiệm là đồng nhất nhau.
Đánh giá độ đồng nhất bằng kỹ thuật ELISA. Mỗi mẫu cần đánh giá cần lấy ra ít nhất 15 ống nghiệm đối với số mẫu sản xuất <200 phịng thí nghiệm. Trong trường hợp nhiều hơn 200 phịng thí nghiệm, số mẫu kiểm tra độ đồng nhất tốt nhất là khoảng 10%. Trong điều kiện không cho phép nếu cỡ mẫu 1000 phịng thí nghiệm thì số ống kiểm tra độ đồng nhất tối thiểu là 30 ống cho một mẫu, mỗi ống nghiệm được xét nghiệm trên 02 giếng ELISA.
Chúng tôi sử dụng phương pháp phân tích phương sai 1 yếu tố (one way ANOVA) để đánh giá độ đồng nhất của mẫu. Phương pháp này chia phưong sai của 1 quan sát (observation) thành 2 phần: phương sai giữa các nhóm (between groups) và phương sai nội nhóm (within group). Do phưong sai là độ phân tán tương đối của
các quan sát so với số trung bình nên việc phân tích phương sai giúp so sánh các số trung bình dễ dàng (bên cạnh việc so sánh các phương sai).
Với giả thuyết H0 là các nhóm (tổng thể) có trung bình bằng nhau: H0: µ1 = µ2 =… = µi = µk; trong đó, µi là trung bình của nhóm thứ i.
Giả thuyết đối H1 : có ít nhất hai trung bình là khác nhau. Các bước tiến hành kiểm định:
Tổng các biến thiên giữa các nhóm SSG là:
2 1 k i i SSG Y Y
Tổng các biến thiên trong nội bộ nhóm SSW là:
2 1 1 i n k ij i i j SSW Y Y
- Tổng biến thiên trong nhóm và giữa các nhóm SST:
2 1 1 i n k ij i j SST SSG SSW Y Y Loại biến thiên Tổng biến thiên Bậc tự do Trung bình biến thiên F Giữa các nhóm SSG df1=k – 1 MSG = SSG/(k – 1) MSG/MSW Nội bộ nhóm SSW df2=n – k MSW = SSW/(n – k) Tổng SST n – 1
Quy tắc bác bỏ H0 là nếu giá trị thống kê F lớn hơn giá trị tới hạn Fα,k-1,n-k (tra bảng phân phối F)
2.3.4.2. Đánh giá độ ổn định
Để đảm bảo các mẫu chuyển đến các đơn vị đạt độ ổn định, song song với bộ mẫu gửi đến các đơn vị để thực hiện ngoại kiểm, 10 đơn vị ở các vùng xa có điều kiện vận chuyển khó khăn nhất sẽ nhận được hai bộ mẫu trong đó một bộ được thực hiện ngoại kiểm theo thường quy và một bộ được gửi trả lại Viện VSDTTƯ. Khi các bộ mẫu chuyển trở lại sẽ được tiến hành xét nghiệm để đánh giá độ ổn định của bộ mẫu sau khoảng thời gian vận chuyển dưới điều kiện thường không bảo quản
[60, 71]. Các mẫu này sẽ được xét nghiệm cùng với các mẫu bảo quản tại Viện VSDTTƯ tại 4oC. Để đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn nghiên cứu sử dụng phương pháp thống kê T test.
Phép kiểm chứng t-test độc lập giúp chúng ta xác định xem chênh lệch giữa giá trị trung bình của hai nhóm khác nhau có khả năng xảy ra ngẫu nhiên hay khơng.
Trong phép kiểm chứng t-test độc lập, chúng ta tính giá trị p, trong đó: p là xác xuất xảy ra ngẫu nhiên.
Giá trị p Giá trị trung bình của 2 nhóm ≤ 0,05 Chênh lệch có ý nghĩa
> 0,05 Chênh lệch khơng có ý nghĩa
Sử dụng Exel để tính T test như hình 7.
Hình 7: Cách tính T test thơng qua phần mềm Exel
2.3.4.3. Kiểm tra vô khuẩn
Kiểm tra vô trùng qua việc cấy mẫu huyết thanh trên thạch thường và canh thang thường. Cho 1µl huyết thanh vào ống môi trường thạch thường, canh thang thường. Môi trường thử vô trùng ủ 37oC, thử nấm để 22oC. Theo dõi trong 14 ngày đọc kết quả [17].
2.4. Áp dụng bộ mẫu với các phịng thí nghiệm tại Việt Nam.
Đánh giá hiệu quả và chất lượng thực tiễn của bộ mẫu thông qua việc gửi bộ mẫu đến các đơn vị thực hiện xét nghiệm HIV trong cả nước, bao phủ tất cả các tuyến, trung ương, tỉnh, huyện, xã. Bộ mẫu gửi đến các đơn vị gồm 10 mẫu (mẫu âm tính, mẫu dương tính).
Các đơn vị thực hiện xét nghiệm theo hướng dẫn và trả kết quả về nhà cung cấp.
Các đơn vị gửi bản nhận xét về chất lượng bộ mẫu cũng như bản đánh giá mức độ khó, dễ khi thực hiện.
Báo cáo sơ bộ phản hổi về kết quả chuẩn được gửi đến các đơn vị tham gia để đối chiếu. Sau đó các kết quả được nhập vào phần mềm và xử lý số liệu. Báo cáo kết quả cuối cùng và báo cáo cho từng đơn vị sẽ được gửi đến các đơn vị sau khi phân tích số liệu.
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘ MẪU NGOẠI KIỂM KIỂM
3.1.1. Kết quả phân tích đặc điểm bộ mẫu chuẩn
Các mẫu huyết tương từ ngân hàng máu được thu thập về phịng thí nghiệm bảo quản tại nhiệt độ -80oC. Khi tiến hành sản xuất sẽ được rã đông tự nhiên và tiến hành xét nghiệm xác định các đặc tính sinh học đối với HIV. Kết quả xét nghiệm đặc điểm mẫu với kỹ thuật Elisa thế hệ thứ ba và thứ tư được thể hiện ở Bảng 4.
Bảng 4: Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng kỹ thuật Elisa
OD CO OD/CO OD CO OD/CO OD CO OD/CO
1 SB-HIV 01 0.12 0.22 0.54 0.02 0.11 0.17 0.21 0.33 0.66 2 SB-HIV 02 0.21 0.22 0.94 0.01 0.11 0.08 0.12 0.33 0.38 3 SB-HIV 03 0.11 0.22 0.47 0.02 0.11 0.17 0.11 0.33 0.34 4 SB-HIV 04 0.32 0.22 1.43 0.01 0.11 0.09 0.26 0.33 0.79 5 SB-HIV 05 0.1 0.22 0.44 0.02 0.11 0.17 0.21 0.33 0.66 6 SB-HIV 06 0.13 0.22 0.59 0.01 0.11 0.10 0.23 0.33 0.72 7 SB-HIV 07 0.11 0.22 0.49 0.01 0.11 0.13 0.25 0.33 0.75 8 SB-HIV 08 0.42 0.22 1.85 0.02 0.11 0.17 0.16 0.33 0.48 9 SB-HIV 09 0.11 0.22 0.51 0.03 0.11 0.23 0.25 0.33 0.75 10 SB-HIV 10 0.11 0.22 0.50 0.01 0.11 0.07 0.24 0.33 0.74 11 SB-HIV 11 0.2 0.22 0.90 0.02 0.11 0.15 0.15 0.33 0.45 12 SB-HIV 12 0.11 0.22 0.50 0.05 0.11 0.41 0.12 0.33 0.37 13 SB-HIV 13 0.42 0.22 1.88 0.03 0.11 0.23 0.21 0.33 0.65 14 SB-HIV 14 0.15 0.22 0.65 0.02 0.11 0.14 0.13 0.33 0.40 15 SB-HIV 15 3.5 0.22 15.63 3.68 0.11 33.77 3.45 0.33 10.62 16 SB-HIV 16 3.37 0.22 15.02 3.57 0.11 32.74 2.87 0.33 8.83 17 SB-HIV 17 3.55 0.22 15.83 3.57 0.11 32.73 3.20 0.33 9.85 18 SB-HIV 18 3.25 0.22 14.50 3.58 0.11 32.82 3.45 0.33 10.62 19 SB-HIV 19 2.38 0.22 10.62 3.59 0.11 32.91 3.12 0.33 9.60 STT Mã số mẫu Sinh phẩm xét nghiệm
Murex HIV Ag/Ab
Genscreen HIV 1/2
Các mẫu cũng được tiến hành xét nghiệm với các kỹ thuật xét nghiệm đơn giản và nhanh. Kết quả được thể hiện tại Bảng 5.
Bảng 5: Kết quả xác định đặc tính mẫu bằng kỹ thuật nhanh/đơn giản
1 SB-HIV 01 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 2 SB-HIV 02 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 3 SB-HIV 03 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 4 SB-HIV 04 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 5 SB-HIV 05 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 6 SB-HIV 06 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 7 SB-HIV 07 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 8 SB-HIV 08 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 9 SB-HIV 09 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 10 SB-HIV 10 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 11 SB-HIV 11 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 12 SB-HIV 12 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 13 SB-HIV 13 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 14 SB-HIV 14 (-) (-) (-) (-) (-) (-) 15 SB-HIV 15 + + + + + + 16 SB-HIV 16 + + + + + + 17 SB-HIV 17 + + + + + + 18 SB-HIV 18 + + + + + + 19 SB-HIV 19 + + + + + + 20 SB-HIV 20 + + + + + + Card test HIV 1/2 Acon HIV 1/2 Double check gold HIV 1/2 STT Mã số mẫu Sinh phẩm sử dụng Serodia HIV 1/2 mix Determine HIV 1/2 SD Bioline HIV 1/2
Từ Bảng 4 và 5 cho ta thấy các mẫu mang mã số SB-HIV 01; SB – HIV 02; SB – HIV 03; SB – HIV 05; SB – HIV 06; SB-HIV-07; SB-HIV 09; SB-HIV 10; SB-HIV 11; SB-HIV 12 và SB-HIV 14 cho kết quả âm tính với tất cả các sinh phẩm thực hiện, vì vậy những mẫu này sẽ được lựa chọn để đưa vào quá trình sản xuất cho những mẫu âm tính. Cịn các mẫu SB-HIV 15; SB-HIV 16; SB-HIV 17; SB- HIV 18; SB-HIV 19 và SB-HIV 20 có kết quả dương tính cao với tất cả sinh phẩm
thực hiện. Những mẫu có kết quả dương tính này sẽ được lựa chọn vào bộ mẫu cho những mẫu dương tính.
Những mẫu với mã số SB-HIV-04; SB-HIV-08 và SB-HIV-13 có kết quả dương tính yếu với kỹ thuật Elisa Murex HIV Ag/Ab và âm tính với sinh phẩm Elisa Genscreen HIV 1/2 Version 2 và SD HIV 1/2 Elisa 3.0, âm tính với các sinh phẩm xét nghiệm nhanh. Những mẫu này sẽ bị loại ra khỏi q trình sản xuất. Mẫu có mã số SB-HIV 15 có mật độ quang với cả 3 sinh phẩm Elisa cao vì vậy chúng ta sử dụng để pha loãng nồng độ của mẫu để tạo ra những mẫu dương tính có nồng độ khơng q cao. Kết quả mẫu pha loãng được thể hiện ở Bảng 6.
Bảng 6: Kết quả pha loãng mẫu SB-HIV 15
Serodia HIV 1/ 2 mix Det ermine HIV 1/ 2 SD B ioline HIV 1/ 2 A con HIV 1/ 2
OD CO OD/CO OD CO OD/CO OD CO OD/CO
1 SB-HIV 15 1/2 3.629 0.12 29.99 3.618 0.219 16.52 3.634 0.306 11.88 + + + + 2 SB-HIV 15 1/4 3.59 0.12 29.67 3.616 0.219 16.51 3.576 0.306 11.69 + + + + 3 SB-HIV 15 1/8 3.462 0.12 28.61 3.552 0.219 16.22 3.563 0.306 11.64 + + + + 4 SB-HIV 15 1/16 3.436 0.12 28.40 3.603 0.219 16.45 3.423 0.306 11.19 + + + + 5 SB-HIV 15 1/32 3.438 0.12 28.41 3.549 0.219 16.21 3.33 0.306 10.88 + + + + 6 SB-HIV 15 1/64 3.356 0.12 27.74 3.52 0.219 16.07 3.15 0.306 10.29 + + + + 7 SB-HIV 15 1/128 3.132 0.12 25.88 3.301 0.219 15.07 2.778 0.306 9.08 + + (+/-) + 8 SB-HIV 15 1/256 2.44 0.12 20.17 2.429 0.219 11.09 1.784 0.306 5.83 + (+/-) (+/-) (+/-) 9 SB-HIV 15 1/512 1.527 0.12 12.62 1.448 0.219 6.61 0.998 0.306 3.26 + (+/-) (-) (-) 10 SB-HIV 15 1/1024 0.875 0.12 7.23 0.852 0.219 3.89 0.563 0.306 1.84 (+/-) (+/-) (-) (-) 11 SB-HIV 15 1/2048 0.484 0.12 4.00 0.503 0.219 2.30 0.388 0.306 1.27 (-) 12 SB-HIV 15 1/4096 0.255 0.12 2.11 0.288 0.219 1.32 0.263 0.306 0.86 (-) 13 SB-HIV 15 1/8192 0.142 0.12 1.17 0.175 0.219 0.80 0.22 0.306 0.72 (-) 14 SB-HIV 15 1/16384 0.08 0.12 0.66 0.121 0.219 0.55 0.187 0.306 0.61 (-) 15 SB-HIV 15 1/32768 0.054 0.12 0.45 0.101 0.219 0.46 0.185 0.306 0.60 (-) STT Mã số mẫu Sinh phẩm xét nghiệm E.Genscreen HIV
1/2 V2 E.Murex HIV Ag/Ab
E.Genscreen Ultra Ag/Ab
Với nồng độ pha loãng 1/64 các sinh phẩm Elisa thế hệ thứ 3 và thứ 4 được xét nghiệm có kết quả dương tính, đối với các kỹ thuật nhanh, đơn giản cũng cho kết quả dương tính trong phạm vi đọc được kết quả. Tuy nhiên khi pha loãng với thể tích mẫu lớn thì tỷ lệ này có thể cho kết quả khơng an tồn đối với sinh phẩm xét nghiệm nhanh SD Bioline HIV 1/2.
Bên cạnh đó mẫu với tỷ lệ pha lỗng 1/32 thì cho kết quả rõ ràng với tất cả các sinh phẩm xét nghiệm. Tuy nhiên với nồng độ pha loãng mẫu này ta sẽ có kết quả của các sinh phẩm Elisa quá cao. Vì vậy, nồng độ 1/50 được lựa chọn để đảm bảo các mẫu sau khi pha loãng cho các kết quả dương tính ở mức độ an tồn, có kết quả rõ ràng. Bảng 7 là kết quả của mẫu pha loãng với nồng độ 1/50.
Bảng 7: Kết quả mẫu sau pha loãng tại nồng độ lựa chọn
Serodia HIV 1/2 mix Determine HIV 1/2 SD Bioline HIV 1/2 Acon HIV1/2
OD CO OD/CO OD CO OD/CO OD CO OD/CO
1
SB0911-
1/50 3.361 0.115 29.23 3.527 0.217 16.25 3.199 0.308 10.39 + + + + STT Mã số mẫu
Sinh phẩm xét nghiệm
E.Genscreen HIV 1/2 V2 E.Murex HIV Ag/Ab
E.Genscreen Ultra Ag/Ab
Với kết quả như Bảng 7 cho ta thấy kết quả này có thể sử dụng cho mẫu dương tính vừa.
Để lựa chọn mẫu âm tính cho bộ mẫu chuẩn những mẫu âm tính với tất cả các sinh phẩm xét nghiệm sẽ được lựa chọn. Mẫu có phản ứng dương tính giả với bất kỳ sinh phẩm nào sẽ bị loại bỏ. Từ bảng 1 chúng ta sẽ lựa chọn ra 6 mẫu âm tính với tất cả các sinh phẩm sử dụng và lựa chọn ra 2 mẫu dương tính và mẫu dương tính pha lỗng đã được thực hiện ở trên. Các mẫu sau khi đã được lựa chọn được chuyển đổi từ huyết tương thành huyết thanh.
3.1.2 Kết quả chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh
Mẫu chuẩn thường là những mẫu càng gần với các mẫu bệnh phẩm được thực hiện tại các phịng thí nghiệm càng tốt. Mặc dù các sinh phẩm xét nghiệm HIV hiện nay đều có thể thực hiện được với cả mẫu huyết thanh và huyết tương và nhiều loại có thể xét nghiệm với máu tồn phần. Tuy nhiên mẫu thực hiện tại các phịng thí nghiệm HIV hiện nay là mẫu huyết thanh. Mà các đơn vị mẫu thu thập về đều từ các ngân hàng máu nên mẫu sẽ được thu thập dưới dạng huyết tương. Thêm vào đó
sử dụng huyết tương có thể chất lượng mẫu khơng cao do có hiện tượng tạo các cục đơng fibrin.
Trong nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp Thrombin hóa và phương pháp phục hổi Canxi để chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh. Với phương pháp phục hồi bằng Canxi chúng tôi thử nghiệm ở các nồng độ Canxi khác nhau 0,001M; 0,005M, 0,008M, 0,01M, 0,05M, 0,1M, kết quả như Hình 8:
Hình 8: Thử nghiệm phục hồi Caxi với các nồng độ khác nhau
Ở các nồng độ khác nhau cho thấy việc tạo cục đông fibrin khác nhau. Với nồng độ 0,01M và 0,005M sợi tơ huyết hình thành khơng đáng kể, cịn tại nồng độ 0,05M và 0,1M cục đông tạo thành cục tơ huyết cứng. Sau khi cất đông và tan đông lượng huyết thanh thu được khơng đáng kể. Qua đó nghiên cứu sử dụng nồng độ 0.01M để tiến hành cho các mẫu lựa chọn.
Từ kết quả chuẩn tại bảng 1 lựa chọn 10 mẫu, chia mỗi mẫu ra thành 2 ống sau đó tiến hành song song một ống cho CaCl2 và một ống cho Thrombin. Kết quả thể hiện tại Hình 9.
Hình 9: Hình ảnh mẫu chuyển từ huyết tương thành huyết thanh qua 2 phương pháp Thrombin và phục hồi Canxi 2 phương pháp Thrombin và phục hồi Canxi
Qua hình 9 cho ta thấy sự tạo cục đơng fibrin giữa hai phương pháp có sự khác nhau. Với ống mẫu chuyển huyết tương thành huyết thanh theo phương pháp Thrombin: các ống mẫu trong, cục đơng fibrin co rõ nét. Cịn đối với ống mẫu phục hồi bằng Canxi cục đông fibrin tạo thành không rõ nét, sợi huyết tạo thành từng cục nhỏ lẫn trong huyết thanh, tạo cho ống mẫu đục, lượng huyết thanh tạo thành khơng nhiều.
Q trình chuyển đổi từ huyết tương thành huyết thanh hồn tất, mẫu dương tính được ủ tại nhiệt độ 56oC trong 1h nhằm bất hoạt vi rút đảm bảo an toàn cho người sử dụng cũng như quá trình vận chuyển. Mẫu âm tính khơng tiến hành bất hoạt do các mẫu âm tính đã được xét nghiệm chẩn đốn âm tính với vi rút HIV và các tác nhân gây bệnh khác như viêm gan B, giang mai, ký sinh trùng sốt rét. Ngoài ra việc bất hoạt mẫu âm tính có thể gây ra các phản ứng dương tính giả khi thực hiện xét nghiệm.
Việc thực hiện ly tâm hay các công đoạn lọc đều được thực hiện riêng biệt, các mẫu âm tính hồn tất q trình ra ống sau đó khử trùng tủ an tồn sinh học rồi mới tiến hành sản xuất các mẫu pha lỗng sau đó là mẫu dương tính.