2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3 Kỹ thuật chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh
Hiện nay các phịng thí nghiệm HIV thực hiện việc xét nghiệm phát hiện dựa trên các mẫu huyết thanh thu thập từ khách hàng. Tuy nhiên các mẫu do ngân hàng máu từ các trung tâm truyền máu thu thập là mẫu huyết tương. Vì vậy các mẫu huyết tương này được chuyển đổi thành huyết thanh bằng phương pháp Thrombin hóa hoặc phục hồi lại Canxi.
Kỹ thuật Thrombin hóa
- Lọ Thrombin 9,43mg 236 NIH units/mgpr; T4648-1KU025 được cho thêm 2ml nước cất tiệt trùng để đảm bảo nồng độ 500 đơn vị/ml hay 0,5 đơn vị/µl. Lắc đều để đạt nồng độ Thrombin đồng nhất.
- Cho Thrombin vào chai huyết tương với thể tích 0,1 µl Thrombin đã hồi chỉnh/ 1ml huyết tương.
- Lắc nhẹ nhàng bằng tay trong 1 phút.
- Ủ tại bể ổn nhiệt với nhiệt độ 37oC trong vòng 1-2 giờ. Sau khi ủ 1 giờ cần kiểm tra việc tạo cục tơ huyết.
- Khi cục tơ huyết đã tạo thành mang chai mẫu ra nhiệt độ phòng chờ 1 giờ rồi cho vào tủ âm sâu tối thiểu âm 20oC, để qua đêm 2-3 ngày.
- Rã đông tự nhiên tại nhiệt độ phòng, phần dịch nổi thu được chính là huyết thanh.
Phương pháp phục hồi lại Canxi
- Pha dung dịch CaCl2.2H2O 2Mol/l bằng cách cho 3g CaCl2.2H2O vào 10ml dung dịch nước cất.
- Cho 0,5ml dung dịch CaCl2 mới pha vào 100ml huyết tương, trộn đều và ủ ở bể ổn nhiệt trong 37oC trong 1-2 giờ (nồng độ pha loãng cuối cùng đạt 0,01 CaCl2). - Nếu huyết tương không tạo thành cục tơ huyết, có thể cho thêm CaCl2 nhưng khơng vượt q 1% của dung dịch 2mol/lít và phải ủ lâu hơn.
- Khi cục tơ huyết đã tạo thành mang chai mẫu ra nhiệt độ phòng chờ 1 giờ rồi cho vào tủ âm sâu tối thiểu âm 20oC qua đêm.
- Sau khi qua đêm tại nhiệt độ âm sâu, ngày hôm sau rã đông tự nhiên tại nhiệt độ phòng, phần dịch nổi thu được chính là huyết thanh [11, 71]
Bất hoạt mẫu HIV dương tính bằng nhiệt
Virut HIV khơng bền với nhiệt, vì vậy để đảm bảo an toàn, toàn bộ các mẫu được chẩn đốn dương tính với HIV được bất hoạt tại nhiệt độ ở 56oC trong 60 phút. Sử dụng bể ổn nhiệt để duy trì nhiệt độ 56oC cho các chai mẫu. Các mẫu sau khi bất hoạt sẽ khơng có khả năng lây nhiễm.
Lọc mẫu
Mẫu chuẩn sử dụng để gửi đến các đơn vị cần có chất lượng tốt, trong, khơng tán huyết hay nhiễm khuẩn. Chính vì vậy, tùy thuộc vào chất lượng các mẫu huyết thanh âm và dương tính được chuyển tới từ ngân hàng mẫu, trong q trình xử lý mẫu có thể có những mẫu sẽ phải lọc bằng màng lọc chuyên dụng để loại bỏ những
vi sinh vật và những sợi tơ huyết nếu còn sau ly tâm sẽ bị giữ lại trên phin lọc. Huyết thanh được lọc tại phin lọc 5 micron sau đó lọc tiếp qua phin lọc 0,22 micron.
Cho chất bảo quản
Mặc dù phin lọc có thể loại bỏ vi khuẩn và nấm mốc, tuy nhiên huyết thanh vẫn có thể dễ dàng bị nhiễm khuẩn ở các cơng đoạn sau. Vì vậy, các mẫu huyết thanh âm và dương tính được cho chất bảo quản như Thiomesal (0,01%), Proclin 300 có tác dụng diệt khuẩn nhằm đảm bảo các mẫu không bị nhiễm khuẩn trong thời sử dụng và mẫu có thể bảo quản tại nhiệt độ phòng trong thời gian vận chuyển mà không ảnh hưởng đến chất lượng của mẫu.
Các mẫu này sau đó được khiểm tra khả năng khơng nhiễm khuẩn bằng môi trường thạch canh thang. Theo dõi trong tủ ấm 37oC trong vòng 14 ngày [11, 71].