3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG BỘ MẪU
3.2.2. Đánh giá độ ổn định mẫu
Các mẫu sau khi đã đảm bảo đồng nhất chúng tôi tiến hành chia ra các ống cryo với thể tích 1ml mỗi ống. Để 20 ống tại nhiệt độ 4-8oC; 20 ống được bảo quản tại nhiệt độ phịng. Những ống cịn lại được đóng gói và gửi đến các đơn vị khó khăn trong việc vận chuyển. Mặc dù bộ mẫu chuẩn khi sản xuất đã cho chất bảo quản làm ngăn ngừa quá trình phát triển của nấm mốc và các vi sinh vật gây phân hủy protein vì vậy các mẫu sẽ khó bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ phòng và giúp cho chất lượng mẫu được ổn định lâu dài. Tuy nhiên các mẫu sau khi sản xuất cần được đánh giá lại tính ổn định một cách chính xác cho từng vòng ngoại kiểm nhằm đảm bảo các đơn vị tham gia nhận được những bơ mẫu có chất lượng tốt.
Hình 13: Kết quả xét nghiệm mẫu bảo quản tại 4 oC và nhiệt độ phòng sau 50 ngày.
Hình 13 là kết quả so sánh hai mẫu được bảo quản tại 4oC và nhiệt độ phòng trong thời gian 50 ngày. Kết quả kiểm tra chất lượng mẫu tại các nhiệt độ 4oC, nhiệt độ phịng khơng có sự khác biệt. Các mẫu tại hai nhiệt độ bảo quản vẫn cho kết quả rõ ràng và tương đồng với kết quả khi bắt đầu sản xuất.
Song song với việc kiểm tra độ ổn định tại Phịng thí nghiệm bộ mẫu sản xuất được gửi đến 10 đơn vị có địa chỉ tại các tỉnh xa xơi và khó khăn trong việc
Sau đó các bộ mẫu này được gửi trở lại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để tiến hành xét nghiệm so sánh với các bộ mẫu được bảo quản tại nhiệt độ 4-8oC. Thời gian bộ mẫu được chuyển đến đơn vị và chuyển trả lại phịng thí nghiệm được thể hiện tại Hình 14.
Từ Hình 14 cho ta thấy thời gian đơn vị xa nhất nhận được bộ mẫu chuẩn là 12 ngày, đơn vị gần nhất là 4 ngày. Tuy nhiên thời gian để chuyển mẫu từ đơn vị về đến Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương thấp nhất là 5 ngày nhưng cao nhất lên đến 18 ngày. Nên tổng thời gia gửi đi và gửi lại lên đến 30 ngày.
Hình 14: Thời gian bộ mẫu vận chuyển tại nhiệt độ thường đến các đơn vị và quay trở lại Viện VSDTTƯ.
Để đánh giá độ ổn định cho các mẫu gửi đến các đơn vị chúng tôi sử dụng kỹ thuật Elisa, do kỹ thuật này là kỹ thuật bán định lượng vì vậy dựa vào mật độ quang của các mẫu chúng ta sẽ đưa các số liệu vào hàm thống kê T test để từ đó đánh giá độ ổn định của mấu.
Kết quả đánh giá độ ổn định của bộ mẫu được thể hiện tại Bảng 12. Từ bảng số liệu với kiểm định T student hai đuôi cho ta thấy giá trị P với mẫu âm tính theo tính tốn = 0,341 và P của mẫu dương tính = 0,351. Như vậy cả hai mẫu âm tính và dương tính được đánh giá này đều có giá trị > P tới hạn (0,05). Điều đó có nghĩa chất lượng của mẫu đã đảm bảo tính ổn định.
Trong trường hợp các bộ mẫu gửi đến các đơn vị và gửi trả về Viện VSDTTƯ xét nghiệm cho kết quả không đảm bảo độ ổn định, Viện VSDTTƯ sẽ thông báo đến các đơn vị yêu cầu hủy và không thực hiện xét nghiệm ngoại kiểm với những bộ mẫu này.
Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của mẫu chuẩn
TT Mã PXN D1 D2 Mean D1 D2 Mean D1 D2 Mean D1 D2 Mean
1 A 0.39 0.42 0.41 0.41 0.47 0.44 12.67 12.58 12.62 13.36 13.18 13.27 2 B 0.38 0.41 0.39 0.49 0.45 0.47 13.06 13.25 13.15 12.07 11.96 12.02 3 C 0.42 0.41 0.42 0.41 0.45 0.43 8.82 9.21 9.02 12.98 13.06 13.02 4 D 0.45 0.53 0.49 0.47 0.41 0.44 12.03 12.52 12.28 12.27 12.72 12.49 5 E 0.41 0.40 0.40 0.39 0.41 0.40 13.38 12.53 12.95 12.79 13.35 13.07 6 F 0.51 0.38 0.44 0.40 0.38 0.39 12.97 14.18 13.57 12.48 12.88 12.68 7 G 0.45 0.38 0.42 0.45 0.50 0.47 12.32 13.03 12.68 13.31 13.01 13.16 8 H 0.43 0.42 0.43 0.38 0.58 0.48 12.65 12.67 12.66 13.18 13.16 13.17 9 I 0.53 0.43 0.48 0.49 0.45 0.47 12.09 12.42 12.25 12.51 12.41 12.46 10 J 0.41 0.41 0.41 0.41 0.45 0.43 12.85 12.99 12.92 12.87 13.32 13.09
P-value= 0.341, nghĩa làlớn hơn P-value= 0.351,nghĩa làlớn hơn
P -value of t -t est = 0.341 0.351
Mẫu âm tính Mẫu dương tính
Mã số mẫu NIHE HIV 02 NIHE HIV 01
Nơi lưu giữ Mẫu chuyển đi Mẫu ở 4oC tại NIHE Mẫu chuyển đi Mẫu ở 4oC tại NIHE
Ghi chú Nếu giá trị P-value > 0.05 , Chất lượng của mẫu đủ độ ổn định Nếu P-value < 0.05 , Chất lượng của mẫu không đủ ổn định
Kết luận: P Critical (0.05) P Critical (0.05)
Mẫu đủ ổn định. Mẫu đủ ổn định.
Song song với việc thực hiện xét nghiệm Elisa để đánh giá độ ổn định của mẫu nghiên cứu cũng thực hiện đánh giá độ ổn đinh đối với sinh phẩm nhanh. Kết quả thể hiện tại hình 15, 16.
Hình 15: Kết quả xét nghiệm với sinh phẩm Determine HIV1/2
A- Mẫu bảo quản tại tủ 4oC
A
Hình 16: Kết quả xét nghiệm với sinh phẩm SD bioline HIV 1/2
A- Mẫu bảo quản tại tủ 4oC
B – Mẫu vận chuyển tại nhiệt độ thường đến đơn vị và gửi lại Viện (đơn vị lâu nhất) 3.2.3. Đánh giá tính vơ khuẩn của bộ mẫu
Các mẫu sau khi sản xuất được lấy để đánh giá tính vơ khuẩn bằng cách cấy trên thạch thường và canh thang thường trong vòng 14 ngày tại nhiệt độ 37oC và 22oC. Sử dụng lúp cấy lấy mẫu huyết thanh phủ lên bề mặt canh thang thường và đưa vào tủ ấm cài đặt 37oC, tiến hành trên 5 ống và 3 ống để tại nhiệt độ 22oC. Kết quả kiểm tra 14 ngày thể hiện tại bảng 13.
Bảng 13: Kết quả độ vô trùng của mẫu chuẩn
Ngày kiểm tra
Ủ tại 37o C Ủ tại 22o C Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6 Ống 7 Ống 8 Ngày 1 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Ngày 3 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Ngày 5 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Ngày 7 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Ngày 9 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Ngày 11 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) Ngày 14 (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) (-) A B
3.2.4. Đánh giá chất lượng mẫu thông qua phiếu khảo sát
Bộ mẫu cũng được gửi đến 20 đơn vị trong cả nước, các đơn vị nhận mẫu sẽ thực hiện theo thường quy để đánh giá chất lượng của bộ mẫu.
Ngoài việc quan tâm đến kết quả thực hiện bộ mẫu tại các đơn vị, nghiên cứu còn gửi bản đánh giá nhận xét về bộ mẫu cho các đơn vị. Hình 17 là kết quả đánh giá của các đơn vị sử dụng về bộ mẫu. Qua biểu đồ này cho ta thấy các đơn vị đều có đánh giá cao về chất lượng bộ mẫu với số điểm 4,9/5, việc đóng gói và hướng dẫn thực hiện bộ mẫu đạt 4,85/5. Điểm số tổng thể về sự hài lòng của người sử dụng với bộ mẫu đạt 4,9/5.
Hình 17: Đánh giá sơ bộ của người sử dụng về bộ mẫu
3.3. QUY TRÌNH SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM
Từ các kết quả trên nghiên cứu đã xây dựng quy trình chi tiết sản xuất mẫu chuẩn cho chương trình đánh giá chất lượng xét nghiệm các phịng thí nghiệm huyết thanh học HIV từ bên ngoài ( phần phụ lục). Tóm tắt các bước của quy trình sản xuất mẫu chuẩn cho chương trình đánh giá chất lượng phịng thí nghiệm huyết thanh học HIV từ bên ngoài được thể hiện theo lược đồ như sau:
XN xác định đặc tính của mẫu huyết tương Mẫu chuyển đến Viện VSDTTW
Cho thrombin (1đv thrombin/2ml huyết tương) Ủ trong ổn nhiệt 37oC x 1-2 giờ
Tạo vón, lưu trữ tại -20oC x 2-3 ngày
Rã đơng
Mẫu dương tính Mẫu âm tính
Bất hoạt 56oC x 1 giờ
Loại bỏ tơ huyết
Ly tâm 10.000vòng x 10p
Cho chất bảo quản
Khuấy từ tại 4oC x 4 giờ
Lọc qua Filter lọc 0.22ul
3.4. KẾT QUẢ SẢN XUẤT MẪU NGOẠI KIỂM ÁP DỤNG TRONG ĐIỀU KIỆN VIỆT NAM KIỆN VIỆT NAM
Mẫu sau khi sản xuất đánh giá tại phịng thí nghiệm đạt yêu cầu nghiên cứu này tiếp tục sản xuất theo quy trình xây dựng tại phụ lục ở diện rộng. Các đơn vị nhận được bộ mẫu kèm theo biểu mẫu hướng dẫn chi tiết để thực hiện. Thực hiện xét nghiệm theo thường quy và gửi kết quả về cho Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để đánh giá.
3.4.1. Các đơn vị tham gia chương trình ngoại kiểm
Tổng số phịng thí nghiệm gửi bộ mẫu là 398 đơn vị. Tỷ lệ phần trăm các đơn vị tham gia được thể hiện tại Hình 18, tỷ lệ theo vùng miền được biểu diễn tại Hình 19. Từ Hình 18, 19 chúng ta thấy các đơn vị nhận bộ mẫu được bao phủ trên toàn quốc từ Bắc, Trung, Nam và khu vực Tây ngun, ngồi ra tất cả các phịng thí nghiệm thuộc các tuyến từ trung ương đến tỉnh, huyện và từ trung tâm y tế đến bệnh viện đều nhận được bộ mẫu.
Hình 18: Tỷ lệ phần trăm các đơn vị tham gia chạy mẫu
Số các đơn vị thuộc trung tâm y tế dự phòng tỉnh, huyện, bệnh viện tỉnh và trung tâm phòng chống HIV/AIDS chiếm đa phần tương ứng với 40%, 19%, 17%.
Số lượng các phịng thí nghiệm thuộc khu vực miềm Bắc và Nam chiếm đa số với 48% và 39% (Hình 18).
Hình 19: Tỷ lệ phần trăm các đơn vị theo vùng địa lý
3.4.2. Thời gian trả kết quả của các đơn vị
Các đơn vị sau khi nhận bộ mẫu sẽ tiến hành xét nghiệm theo thường quy và trả báo cáo kết quả về Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Phần lớn các đơn vị trả kết quả trong vòng 14 ngày. Tuy nhiên vẫn còn 59 đơn vị tương ứng với 14.8% các đơn vị trả kết quả sau 14 ngày (Hình 20).
Hình 20: Thời gian các đơn vị gửi kết quả bộ mẫu chuẩn
3.4.3. Độ ổn định của bộ mẫu ngoại kiểm
Khi gửi cho 398 phịng thí nghiệm, bộ mẫu được gửi cho 10 đơn vị xa nhất để đánh giá độ ổn đinh. Kết quả độ ổn định của mẫu sau khi gửi đến đơn vị và được gửi trở lại Viện VSDTTƯ để làm xét nghiệm (Bảng 14).
Bảng 14: Độ ổn định của bộ mẫu gửi đến 398 đơn vị
TT Mã P XN D1 D2 Mean D1 D2 M ean D1 D2 Mean D1 D2 Mean
1 A 12.00 11.95 11.97 12.86 13.16 13.01 0.43 0.46 0.45 0.45 0.56 0.51 2 B 12.01 12.11 12.06 12.07 12.03 12.05 0.32 0.39 0.36 0.53 0.41 0.47 3 C 12.30 12.07 12.19 12.56 12.97 12.76 0.57 0.50 0.54 0.60 0.68 0.64 4 D 13.21 12.72 12.97 12.26 12.26 12.26 0.39 0.32 0.36 0.49 0.49 0.49 5 E 11.46 11.18 11.32 13.08 12.93 13.01 0.50 0.54 0.52 0.68 0.45 0.56 6 F 11.89 12.65 12.27 12.86 12.48 12.67 0.48 0.57 0.53 0.45 0.38 0.42 7 G 12.50 12.39 12.45 12.63 12.05 12.34 0.61 0.68 0.64 0.75 0.64 0.70 8 H 12.29 12.86 12.58 11.99 12.33 12.16 0.71 0.71 0.71 0.41 0.60 0.51 9 I 12.00 12.02 12.01 12.07 12.41 12.24 0.50 0.43 0.46 0.64 0.53 0.58 10 J 12.50 12.20 12.35 12.52 12.97 12.74 0.64 0.57 0.61 0.60 0.53 0.56
P -value= 0.195 , t hat 'smo re th an P -value= 0.475 , that's mo re th an
Ghi chú Nếu giá trị P-value > 0.05 , Chất lượng của mẫu đủ độ ổn định Nếu P-value < 0.05 , Chất lượng của mẫu không đủ ổn định
Kết luận: P Critical (0.05) P Critical (0.05)
Mẫu đủ ổn định. Mẫu đủ ổn định.
Mẫu chuyển đi Mẫu ở 4oC t ại NIHE Mẫu chuyển đi M ẫu ở 4oC tại NIHE
P -value of t-test = 0.195 0.475
Mã số mẫu NIHE HIV 1201-02 NIHE HIV 1201-01
3.4.4. Sinh phẩm các đơn vị thực hiện
Đa số các đơn vị thực hiện xét nghiệm với sinh phẩm nhanh Determine HIV 1/2 (41.53%), đứng ở vị trí thứ hai là sinh phẩm ngưng kết hạt Serodia HIV 1/2 Mix (13.84%), Acon HIV1/2 (10.91%), Murex HIV Ag/Ab (7.82%) (Hình 21).
3.4.5. Kết quả thực hiện của đơn vị tham gia
Trong số 398 đơn vị thực hiện bộ mẫu có 322 đơn vị có kết quả hồn tồn phù hợp với kết quả của Viện VSDTTƯ chiếm 80,9%. 07 phịng thí nghiệm có kết quả khơng phù hợp và 69 phịng thí nghiệm có kết quả phù hợp với kết quả chuẩn tuy nhiên khơng đưa ra kết luận cho tình trạng mẫu (Bảng 15).
Bảng 15: Kết luận của các phịng thí nghiệm về kết quả của bộ mẫu chuẩn Số PXN (n=398) Tỉ lệ % Số PXN (n=398) Tỉ lệ %
Phịng thí nghiệm kết luận phù hợp 322 80,90
Phịng thí nghiệm kết luận khơng phù hợp 7 1,76 Phịng thí nghiệm không đưa ra kết luận về mẫu 69 17,34
Trong bộ mẫu có 2 mẫu pha lỗng và lặp lại, vì vậy nghiên cứu sử dụng phân tích Youden để đánh giá độ chính xác trong việc thực hiện kỹ thuật Elisa của các đơn vị thơng qua việc phân tích kết quả của hai mẫu pha lỗng này. Từ biểu đồ 8 ta thấy các kết quả của phịng thí nghiệm nằm ngồi đường giới hạn màu đỏ (tương ứng ngoài 3SD) và nằm ở vùng II, IV thì đơn vị có kết quả sai số hệ thống. Nếu kết quả nằm ngoài đường mẫu đỏ và thuộc vùng I, III thì đơn vị được coi có sai số ngẫu nhiên. Ta thấy có 2 phịng thí nghiệm có kết quả sai số hệ thống và 3 phịng thí nghiệm có kết quả sai số ngẫu nhiên đối với sinh phẩm Genscreen HIV 1/2 Version 2 (Hình 22).
3.5. BÀN LUẬN
Bộ mẫu chuẩn đánh giá chất lượng các phịng thí nghiệm bao gồm cả mẫu âm tính và dương tính. Mẫu dương tính được thu gom từ các ngân hàng máu bằng cách thu thập các mẫu huyết tương thu thập từ người cho máu. Sau khi thu thập về bịch huyết tương được xét nghiệm sàng lọc bằng sinh phẩm Elisa thế hệ thứ tư gồm phát hiện đồng thời kháng nguyên và kháng thể nếu kết quả dương tính thì mẫu huyết tương sẽ không được sử dụng cho mục đích truyền máu. Các bịch huyết tương này được các trung tâm huyết học chuyển cho Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương để sử dụng cho sản xuất mẫu ngoại kiểm. Hiện nay các chương trình hiến máu tình nguyện đều tiến hành sang lọc trước khi lấy đủ đơn vị máu. Do đó các trường hợp sàng lọc nghi ngờ dương tính đều loại bỏ. Do đó mẫu dương tính sẽ rất hạn chế, khơng thường xun vì vậy đây cũng là một vấn đề khó khăn khi sản xuất.
Với thử nghiệm phục hồi Canxi tại các nồng độ khác nhau đã cho những kết quả khác nhau. Tại nồng độ 0,001M, 0,005M hầu như không tạo ra sợi tơ huyết. Với nồng độ đậm đặc hơn 0,05M và 0,1M lượng tơ huyết tạo thành cục đông cứng do đó lượng huyết thanh thu được khơng nhiều vì vậy mà nghiên cứu đã sử dụng nồng độ Canxi 0,01M. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây của Hàn Quốc, chính vì vậy hiện nay chương trình ngoại kiểm của Hàn Quốc cho xét nghiệm huyết thanh học HIV đã không chuyển đổi huyết tương thành huyết thanh thông qua phương pháp phục hồi Canxi nữa [46]. Nồng độ này cũng phù hợp với các hướng dẫn của WHO [11, 71]. Từ kết quả thử nghiệm chuyển đổi huyết thanh từ huyết tương thông qua hai phương pháp phục hồi Canxi và Thrombin hóa cho thấy sự tạo cục tơ huyết giữa hai phương pháp có sự khác nhau. Với ống mẫu chuyển huyết tương thành huyết thanh theo phương pháp Thrombin: các ống mẫu trong, cục tơ huyết co rõ nét. Còn đối với ống mẫu phục hồi bằng Canxi cục tơ huyết tạo không thành cục rõ nét, tơ huyết thành từng cục nhỏ lẫn trong huyết thanh, tạo cho ống mẫu không trong mà đục, lượng tơ huyết tạo thành không nhiều. Bên cạnh đó các kết quả khơng xác định của mẫu âm tính đối với kỹ thuật ngưng kết hạt cũng gây khó khăn nếu lựa chọn phương pháp này để chuyển đổi huyết
Trong bộ mẫu cịn có mẫu dương tính yếu và việc thu thập mẫu có nồng độ kháng thể kháng HIV thấp là vơ cùng khó. Do đó nghiên cứu đã sử dụng phương pháp pha loãng mẫu. Trong trường hợp nếu đơn vị có kết quả sai lệch mà chúng ta khơng có kết quả đối chứng thì sẽ khó đánh giá kết quả sai của đơn vị vì mẫu khơng