1.5.1. Gen ND6
Gen ND6 nằm trên chuỗi nhẹ của phân tử ADN ty thể, có kích thước gồm
524bp từ vị trí nucleotit 14149 đến nucleotit 14673, có trình tự mã hóa liên tục và hầu như không chứa các đoạn intron [5]. Trên phân tử mARN của gen có bộ ba mở đầu là AUG, và bộ ba kết thúc là UCG, sản phẩm dịch mã của nó là chuỗi polyaxitamin dài 174 axitamin. Ở đầu 3’ của phân tử mARN có trình tự khơng mã hóa gồm 1812 nucleotit là trình tự sợi đối với gen ND5, trình tự này có thể kéo dài qua gen mã hóa cho tARNLeu, tARNSer, tARNHis, gen ND4 và gen mã hóa tARNArg [37].
Gen ND6 mã hóa cho tiểu phần 6-NADH-Ubiquinone oxidoreductase, là một trong bảy tiểu phần protein của phức hệ I trong chuỗi truyền điện tử. Phức hệ I là phức hệ quan trọng trong q trình photphoryl hóa ơxi hóa (oxidative phosphorylation), đảm nhiệm vai trị đầu tiên trong q trình vận chuyển điện tử, nó
chuyển điện tử từ phân tử NADH đến phân tử ubiquinone (Coenzyme Q10), sau đó qua các phức hệ khác để tạo ra ATP. Vì vậy, nó giữ một vai trị vơ cùng quan trọng trong quá trình tổng hợp năng lượng cho tế bào, đột biến xảy ra làm ảnh hưởng tới chức năng bình thường của phức hệ I sẽ làm gián đoạn và ngừng trệ quá trình sản sinh ATP, gây thiếu hụt năng lượng hoạt động, ảnh hưởng tới hoạt động sống của tế bào, dẫn đến bệnh ty thể.
Tuy kích thước gen khơng lớn nhưng gen ND6 lại chứa nhiều điểm đột biến liên quan đến hội chứng LHON (Leber herteditary optic neuropathy) nên gen ND6 được coi là “điểm nóng” của hội chứng LHON[11]. Sáu đột biến trên gen ND6 đã được xác định gây ra LHON là G14459A, T14484C, C14482G, C14498T, C14568T, và T14596A.
1.5.2. Đột biến T14484C
Như đã trình bày ở trên, hiện có 6 đột biến đã được xác định trên gen ND6 liên quan đến hội chứng LHON, trong đó có đột biến T14484C (chiếm 14%).
LHON (Leber herteditary optic neuropathy) là hội chứng liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber, tác động chủ yếu đến võng mạc, gây hội chứng teo dây thần kinh thị giác, làm mất khả năng nhìn thấy ở cả hai mắt. Bệnh có thể gây mù khi còn trẻ và thường xuất hiện ở nam giới. Khoảng 95% trường hợp LHON gây ra bởi các đột biến liên quan đến các tiểu đơn vị của phức hệ I, bao gồm đột biến G11778A trên gen ND4, đột biến G3460A trên gen ND1 và đột biến T14484C trên
gen ND6.
Đột biến T14484C dẫn đến thay thế axit amin Methyonine thành Valine ở vị trí 64 trong chuỗi polypeptide do gen ND6 mã hóa. Một số nghiên cứu cho thấy, các bệnh nhân mang đột biến T14484C có tiên lượng về khả năng phục hồi thị giác tốt nhất so với bệnh nhân mang đột biến khác cũng gây ra hội chứng LHON.
Ngoài ra, đột biến T14484C trên gen ND6 không những gây ra các triệu
chứng của hội chứng LHON mà còn gây ra hội chứng Leigh (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh).
1.6. Một số phƣơng pháp tạo đột biến điểm định hƣớng 1.6.1. Phương pháp Kunkel
Năm 1987, Thomas Kunkel đã giới thiệu một phương pháp tạo đột biến nhân tạo theo dịng thay vì phải chọn lọc nhiều cá thể [26]. Ông chèn đoạn gen cần tạo đột biến vào phagemid rồi biến nạp vào chủng E.coli bị đột biến hai gen quy định tổng hợp hai enzyme dUTPase (dut) và uracil deglycosidase (ung) làm giảm hai enzyme này trong tế bào E.coli. Đây là hai enzyme tham gia cơ chế sửa sai trong quá trình sao chép ADN. Sự thiếu hụt dUTPase sẽ ngăn cản sự thủy phân dUTP trong tế bào làm nồng độ dUTP cao, dễ dàng thay thế nucleotit T trong sao chép ADN. Sự thiếu hụt uracil deglycosidase sẽ ngăn cản việc loại bỏ các nucleotit U xuất hiện trong sợi ADN mới tổng hợp. Phagemid tái bản theo cơ chế vòng tròn lăn tạo ra các sợi đơn ADN mang một số nucleotit U thay vì T. Các sợi đơn này được tách ra khỏi tế bào E.coli và làm khuôn để tổng hợp các sợi mới nhờ mồi mang một vị trí đột biến sai khác được tổng hợp nhân tạo. Sau đó những sợi ADN này được biến nạp vào chủng E.coli bình thường. Cơ chế sửa sai sẽ phân hủy các sợi ADN
bình thường mang nucleotit U và giữ lại các ADN đã được đột biến. Phương pháp này cho phép tạo ra các dịng tế bào đều có chứa ADN đột biến.
1.6.2. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp
Cơ sở của phương pháp này dựa trên hiện tượng trao đổi chéo giữa hai phân tử ADN có trình tự tương đồng. Đoạn gen cần tạo đột biến được chèn vào một vector, biến nạp vào tế bào vi khuẩn và tồn tại như một plasmid của vi khuẩn. Một đoạn ADN tương đồng được tổng hợp nhân tạo đã mang vị trí đột biến sẽ được chuyển vào tế bào vi khuẩn này. Cơ chế trao đổi chéo ngẫu nhiên sẽ tạo ra plasmid mang đột biến mong muốn. Ngoài việc sử dụng vector để cài đoạn chèn, người ta cũng có thể sử dụng nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (Bacterial artificial chromosomes-BAC), cho phép cài đoạn gen có kích thước lớn. Ưu điểm của phương pháp này là vùng tương đồng có thể được lựa chọn tự do miễn là sai khác ở vị trí cần tạo đột biến, thêm vào đó phương pháp này khơng làm thay đổi trình tự đoạn gen đích muốn tạo đột biến [31]. Đây là phương pháp được sử dụng để loại bỏ một đoạn gen hay thay thế gen mong muốn.
1.6.3. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp PCR
1.6.3.1. Sử dụng PCR truyền thống
Khi PCR được sử dụng để tạo đột biến điểm định hướng thì mồi được thiết kế có mang trình tự đột biến (mất, thêm hoặc thay thế bazơ). Trong phản ứng PCR, đột biến được tích lũy, thay thế trình tự ban đầu.
Tuy nhiên, đột biến được tạo bằng phương pháp PCR truyền thống này chỉ được sử dụng với các thay thế nhỏ, mất hoặc thêm ở hai đầu đoạn ADN [41].
Hình 1.7. Tạo đột biến điểm (thay thế) định hƣớng sử dụng PCR truyền thống
1.6.3.2. Sử dụng Primer extention
Trong trường hợp muốn tạo được đột biến thay thế ở nhiều vị trí hoặc mất, thêm đoạn ADN ở giữa đoạn gen ta phải sử dụng phương pháp Primer extention. Trong phương pháp này có hai cặp mồi được thiết kế ở hai đầu đoạn gen, bên trong thiết kế thêm một cặp mồi khác giống như PCR lồng, đầu 3’ bổ sung hồn tồn với khn, đầu 5’ mang đoạn có đột biến. Chu kì PCR đầu sử dụng cả hai cặp mồi, kết quả tạo ra các đoạn sản phẩm có trình tự mang đột biến (nằm trên các cặp mồi trong) gối lên nhau. Trong chu kì PCR thứ hai chỉ sử dụng cặp mồi ngồi, do đó có các đoạn gối lên các sản phẩm PCR bắt cặp với nhau và nhân lên được đoạn gen mang đột biến nằm ở giữa gen [20].
Hình 1.8. Tạo đột biến điểm định hƣớng sử dụng PCR primer extention
1.6.3.3. Sử dụng PCR đảo (Inverse PCR)
PCR đảo cho phép khuếch đại vùng chưa biết trình tự, dùng cho gen đã được nhân dòng vào plasmid. Trong phương pháp này, mồi được thiết kế phụ thuộc vào loại đột biến mong muốn và phải được photphoryl hóa đầu 5’, cần thiết cho phản ứng đóng vịng plasmid thu được sau khi PCR [35].
1.7. Một số phƣơng pháp phát hiện đột biến điểm
1.7.1. Phát hiện đột biến điểm ADN ty thể bằng PCR- RFLP
Kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) là kỹ thuật phân tích tính đa hình chiều dài của các phân đoạn ADN được phân cắt giới hạn. Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên ADN. Sự thay đổi về trình tự nucleotit của ADN có thể dẫn đến sự thêm hay bớt các điểm phân cắt của enzyme giới hạn, làm cho các đoạn ADN phân cắt có kích thước khác nhau, có thể nhận biết được dựa trên phổ băng khi điện di. Như vậy, đột biến xảy ra trong trình tự của ADN tại những vị trí giới hạn đặc hiệu sẽ dẫn đến tính đa hình trong chiều dài của các đoạn ADN giới hạn khi được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn đặc hiệu. Hiện tượng này đã tạo ra sự đa dạng trong chiều dài của các đoạn ADN mà khi điện di chúng trên gel thì có thể phát hiện được các đột biến này.
Cùng với sự phát triển của kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction), kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Trong kỹ thuật PCR, phối hợp khả năng lai đặc hiệu của ADN và khả năng kéo dài chuỗi của ADN polymerase để nhân bản các đoạn ADN khác nhau lên hàng triệu lần so với ban đầu. Do ADN polymerase hoạt động theo nguyên tắc cần phức hợp khn-mồi, trong mơi trường thích hợp có các dNTP thì sẽ kéo dài mồi thành sợi bổ sung với sợi khn. Vì vậy để nhân bản được đoạn ADN đích, người ta cần thiết kế các mồi (primer) đặc hiệu. Kỹ thuật PCR rất nhạy, chỉ cần một lượng nhỏ ADN khn thì phản ứng đã có thể diễn ra. Phối hợp PCR-RFLP sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát hiện các đột biến di truyền trong đó có đột biến điểm ADN ty thể. PCR-RFLP là cơng cụ chẩn đốn được sử dụng phổ biến nhất để phát hiện các đột biến điểm trong ADN ty thể. Phương pháp này bao gồm các bước sau: (1) các đoạn mồi được thiết kế để khuếch đại đoạn ADN ty thể chứa vị trí đột biến; (2) sản phẩm PCR được phân cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp; (3) các đoạn cắt được điện di trên gel agarose hay polyacrylamide khơng biến tính, nhuộm ethidium bromide và được phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại. Các sản phẩm cắt có thể được điện di trên gel polyacrylamide và nhuộm bạc với độ nhạy cao hơn. Việc chọn lựa enzyme giới hạn có ý nghĩa quyết định trong việc phát hiện
đột biến điểm trong ADN ty thể. Dựa trên trình tự nhận biết của enzyme có sẵn trên đoạn ADN chứa đột biến hoặc được chủ động tạo ra do cách thiết kế mồi trong PCR mà có thể xác định được mẫu bị đột biến và không đột biến sau phản ứng cắt enzyme.
Trong phịng thí nghiệm lâm sàng, các đột biến ADN ty thể thường được phát hiện bằng phân tích PCR-RFLP, là phương pháp phổ biến nhất được sử dụng để phát hiện các đột biến điểm ADN ty thể. Đây là phương pháp đơn giản và hiê ̣u quả để phát hiện ADN ty thể đô ̣t biến khi sàng lo ̣c v ới số lượng mẫu lớn . PCR- RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn và ít nguy hiểm hơn phương pháp ASO. Tuy nhiên, phương pháp này có độ nhạy tương đối, đơi khi đột biến khó được phát hiện vì sự có mặt của các băng ADN mờ nhạt trên gel nếu tỷ lệ ADN ty thể đột biến trong mẫu nghiên cứu thấp. Giới hạn phát hiện của phân tích PCR-RFLP nhuộm ethidium bromide (EtBr) là 5-10% [7].
1.7.2. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng xác định trình tự gen
Các đột biến trong ADN ty thể có thể được phát hiện bằng kỹ thuật PCR- RFLP và khẳng định lại bằng xác định trình tự gen. Kỹ thuật giải trình tự cịn được sử dụng để phát hiện, tìm kiếm đột biến mới trong hệ gen ty thể [10].
Xác định trình tự nucleotit có thể phát hiện và khẳng định chắc chắn loại đột biến trên ADN ty thể. Tuy vậy đây cũng là kỹ thuật tốn nhiều thời gian và chi phí cao, vì vậy kỹ thuật xác định trình tự thường được sử dụng để khẳng định sự có mặt của các đột biến trong đó có các đột biến trong ADN ty thể.
Phương pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chưa biết ở bệnh nhân nghi ngờ rới loa ̣n ADN ty thể.
Nhìn chung, có rất nhiều kỹ thuật được sử dụng để phát hiện đột biến điểm trong hệ gen ty thể, mỗi phương pháp đều có những ưu và nhược điểm riêng. Tuy nhiên, phương pháp PCR-RFLP vẫn là một phương pháp đơn giản, hiệu quả được sử dụng phổ biến trong sàng lọc bệnh ty thể. Ở đề tài này, chúng tôi sử dụng phương pháp PCR-RFLP để sàng lọc 4 đột biến trên gen ND6 và MT-TK của hệ gen ty thể.
1.7.3. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng phương pháp SSCP (single-stranded conformational polymorphism) conformational polymorphism)
Kỹ thuật phân tích đa hình cấu hình sợi đơn (SSCP) được cơng bố lần đầu tiên bởi Orita và cộng sự (1989) phát hiện những sai khác dựa trên khả năng di chuyển khác nhau của các đoạn ADN sợi đơn có cùng kích thước nhưng trình tự khác nhau[38]. Chuyển động của ADN trong gel điện di phụ thuộc vào kích thước và cấu hình khơng gian của chúng. Một sự thay đổi nucleotit nhỏ (thêm, mất, thay thế nucleotit) của một trong hai sợi đơn của ADN sợi kép rất khó có thể phân biệt bằng gel điện di, bởi vì các tính chất vật lý của các sợi cặp đơi là gần như giống nhau nên chuyển động của ADN sợi kép trong gel điện di gần như không thay đổi. Tuy nhiên các chuyển động của sợi đơn lại bị ảnh hưởng bởi những thay đổi dù là rất nhỏ trong trình tự (có thể là thay đổi 1 nucleotit trong số vài trăm nucleotit). Sau khi biến tính ADN sợi kép, do tính chất tương đối khơng ổn định của ADN sợi đơn khi vắng mặt của một sợi bổ sung, các trình tự ADN trên sợi đơn có thể gặp các trình tự bổ sung nằm ngay trên sợi ADN đó. Kết quả là chúng bắt cặp với nhau, tạo ra những vòng hoặc nếp gấp, tạo ra những cấu hình khơng gian khác nhau. Sự khác biệt về hình dạng giữa hai sợi đơn với trình tự khác nhau sẽ làm chúng di chuyển khác nhau trên cùng một bản gel điện di, mặc dù số lượng nucleotit là như nhau.
1.8. Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể ở Việt Nam
Ở Việt Nam, đột biến gen ty thể cũng đã bước đầu được phát hiện bằng kỹ thuật PCR-RFLP. Năm 2004, một bệnh nhân MELAS mang đột biến A3243G đã được phát hiện lần đầu tiên bởi Lê Thị Bích Thảo và cộng sự [3] bằng phương pháp PCR-RFLP và giải trình tự nucleotit.
Phạm Hùng Vân và tập thể (2010) đã sử dụng phương pháp giải trình tự trực tiếp ADN ty thể tách chiết từ máu bệnh nhân mang bệnh LHON, và đã xác định thấy 9/12 trường hợp có đột biến ADN ty thể [4].
Năm 2012, nhóm nghiên cứu Trương Thị Huệ và cộng sự đã kiểm tra sự có mặt của đột biến A8344G của hội chứng MERRF, đột biến A3243G của hội chứng MELAS và sự mất đoạn 9 bp giữa gen COII và gen mã hóa cho tRNALys bằng kỹ thuật PCR-RFLP và giải trình trình tự nucleotide [1; 2].
Như vậy đột biến gen ty thể ở bệnh nhân Việt Nam đã bước đầu được nghiên cứu. Tuy nhiên, các thơng tin có được cịn hạn chế. Vì thế, việc nghiên cứu phát hiện đột biến điểm ty thể gây bệnh ở người Việt Nam là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn.
1.9. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài
1.9.1. Mục tiêu
Tạo được các mẫu mang đột biến điểm T14484C trên gen ND6 và đột biến A8344G, T8356C, G8363A trên gen MT-TKđể sử dụng làm đối chứng dương trong quy trình sàng lọc một số bệnh liên quan đến đột biến gen ty thể bằng PCR-RFLP.
1.9.2. Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu tạo các đột biến điểm định hướng: + Nhân dòng đoạn gen quan tâm
+ Thiết kế mồi tạo các đột biến điểm định hướng
+ PCR plasmid nhân dòng với cặp mồi tạo đột biến điểm tương ứng + Đóng vịng sản phẩm PCR rồi biến nạp vào tế bào E. coli
+ Sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid đột biến
+ Tách chiết và giải trình tự các plasmid chứa các vị trí đột biến đã tạo
Sàng lọc 4 đột biến T14484C, T8356C, A8344G, G8363A trên 128 mẫu ADN của các bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể bằng phương pháp PCR-RFLP:
+ Thu thập và bảo quản mẫu ADN của các bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể + Thiết kế mồi, PCR nhân bản các đoạn gen chứa vị trí của 4 đột biến muốn sàng lọc
+ Tiến hành sàng lọc đột biến bằng phương pháp PCR-RFLP với sự có mặt