Bảng 2.11. Trình tự mồi oligonucleotit cho PCR tạo đột biến định hƣớng. Đột biến đƣợc tạo Tên mồi Trình tự nucleotide Kích thƣớc sản phầm PCR A8344G MRG Fw 5’P-ATTAAGAGAGCCCACACCTCTTTAC -3’ 3098bp MRG Rv 5’P- CTTTAACTTAAAAGGTTAATGCTAAAGTTAGC- 3’ T8356C MRC Fw 5’P-CAACACCTCTCTTAAGTGAAATGCC-3’; 3106bp MRC Rv 5’P- GTTCTCTTAATCTTTAACTTAAAAGGTTAATGC- 3’ G8363A MRA Fw
5’P- CTC TTT ACC ATA AAA TGC CCC -3’;
3127bp MRA Rv 5’P- GTG TTG GTT CTC ATC TTC TAG -3’. T14484 C LHC Fw
5’P-CAA AGA CAA CGA CCA TTC CCC C -3’
3010bp LHC
Rv
5’P-GAT ATA CTA CAG CGA TGA ATC GGC C-3’
Các nucleotide gạch chân là các nucleotide được thay đổi tại vị trí cần tạo đột biến.
2.2.5.2. PCR plasmid chứa các đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng
Trong nghiên cứu này, các đột biến điểm được định hướng tạo ra bằng phương pháp PCR đảo (Invert PCR), sử dụng bộ Kit Phusion Site-Directed Mutagenesis® của hãng Thermo.Các phản ứng PCR được tiến hành với ADNkhuôn
là vector tái tổ hợpđược tạo ở trên và đã tối ưu hóa nồng độ với các cặp mồi khác nhau(MRGFw/Rv; MRCFw/Rv và MRAFw/Rv, LHCFw/Rv – có trình tự như trên bảng 2.11). Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.12 và 2.13 chạy trong 25 chu kì. Sản phẩm thu được được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker 1kb.
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR plasmid nhân dòng với mồi chứa vị trí đột biến Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μl) Khn ADN 1 Buffer HF (+Mg 2+) 10X 5 dNTPs 10mM 0.5 Forward primer 10pM 1 Reverse primer 10pM 1
Hot Taq polymerase 5U/µl 0.25
DDW 16.25
Tổng thể tích 25
Bảng 2.13. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với từng loại mồi chứavị trí đột biến Loại đột biến Cặp mồi Chu trình nhiệt (30CK)
T14484C LHC 98oC : 10 giây 66oC : 20 giây 72oC : 2 phút A8344G MRG 98oC : 10 giây 65oC : 20 giây 72oC : 2 phút T8356C MRC 98oC : 10 giây 60oC : 20 giây 72oC : 2 phút G8363A MRA 98oC : 10 giây 56oC : 20 giây 72oC : 2 phút
2.2.5.3. Đóng vịng sản phẩm PCR sử dụng T4-ligase
Sản phẩm PCR là plasmid dạng thẳng được đóng vịng nhờ phản ứng nối bằng enzyme T4-ligase. Thành phần phản ứng được thể hiện trong bảng 2.14.
Bảng 2.14. Thành phần phản ứng đóng vịng sản phẩm PCR Thành phần Thể tích (μl) Điều kiện của phản ứng Thành phần Thể tích (μl) Điều kiện của phản ứng
5X Rapid Ligation Buffer 2
Trộn đều và ủ ở 250C trong 5 phút rồi giữ ở -200C đến khi biến nạp
T4 ADN ligase 0.5
Sản phẩm PCR 1
DDW 6.5
Tổng thể tích 10
2.2.5.4. Biến nạp plasmid đã được đóng vịng vào tế bào khả biến E. coli DH5α và tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến
Hỗn hợp plasmid đã được đóng vịng được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo quy trình được trình bày ở mục 2.2.4.3 rồi sau đó cấy trải trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin thích hợp. PCR trực tiếp chọn lọc các dòng mang plasmid tái tổ hợp, mặc dù đã tối ưu nồng độ khn nhưng vẫn có thể có một lượng plasmid khn dư được biến nạp cùng vì vậy cần tiến hành cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để sàng lọc những dòng mang đoạn gen đã được gây đột biến.
Chọn lọc những khuẩn lạc chứa plasmid mang đoạn gen đột biến đem nuôi lỏng trong mơi trường LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Tách plasmid và điện di trên gel agarose 1%. PCR kiểm tra plasmid với các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen và mồi M13 Fw/Rv là mồi đặc hiệu cho vector và giải trình tự để khẳng định kết quả.
2.2.6. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm. G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm.
Bằng kĩ thuật PCR-RFLP được trình bày ở trên cùng với các mẫu đối chứng chuẩn là các ADN bình thường và các ADN mang đột biến được tạo ra theo quy trình ở phần 2.2.4 và 2.2.5, chúng tơi đã kiểm tra sự có mặt của cả 4 loại đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A trên 128 mẫu bệnh phẩm do bệnh viên Nhi
Trung ương cung cấp. Những mẫu này được lấy từ những bệnh nhân được nghi ngờ mắc các bệnh ty thể.
2.2.7. Điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Các phân tử ADN là các polyanion nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử ADN trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước của chúng và nồng độ gel. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử có kích thước lớn.
Gel agarose 2% được chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt ADN bởi nuclease. Mẫu ADN được trộn với đệm mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và tra vào các giếng trên gel. Quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra ngâm dưới ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 µg/µl 5-7 phút và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh gel. Phương pháp quan sát ADN trong gel agarose thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của acid nucleic và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.
2.2.8. Điện di trên gel polyacrylamide
Gel polyacrylamide được trùng hợp từ acrylamide và bis-acrylamide cùng với ammonium persulphate và TEMED. Phản ứng trùng hợp chuỗi được bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được trùng hợp thành một chuỗi dài. Khi bis- acrylamide được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Kích thước lỗ gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa. Gel polyacrylamide 12% được tổng hợp với các thành phần như trong bảng 2.15.
Bảng 2.15. Thành phần trong bản gel polyacrylamide STT Thành phần Thể tích STT Thành phần Thể tích 1 Dung dịch acrylamide 30% 2 ml 2 TBE 5X 1 ml 3 APS 10% 35 µl 4 TEMED 3,5 µl 5 Nước cất khử trùng 1,965 ml Tổng thể tích 5 ml
Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn được trộn với đệm mẫu và tra vào đường chạy điện di trong đệm TAE 1X với hiệu điện thế ổn định 10vol/cm gel cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Gel được nhuộm bằng EtBr hòa trong nước, sau khoảng 5 phút, bản gel được lấy ra, rửa dưới vòi nước và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.9. Giải trình tự
Các đột biến mtADN được phát hiện bằng PCR-RFLP và được khẳng định lại bằng xác định trình tự gen chứa đột biến.
Nguyên tắc: xác định trình tự dựa theo phương pháp kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide (ddNTP). Khi các ddNTP được gắn vào chuỗi ADN đang tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại (do các nucleotide này chỉ chứa 3’–H thay cho 3’–OH). Như vậy, từ một đoạn ADN ban đầu, nhiều đoạn sợi đơn mới được đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các đoạn này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện di acrylamide dạng maoquản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích kết quả để đưa ra trình tự đoạn ADN gốc.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kiểm tra ADN tổng số của mẫu bệnh phẩm
Mẫu máu của bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể được cung cấp từ Bệnh viện Nhi Trung ương, sau đó ADN tổng số được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi của các bệnh nhân này. ADN tổng số từ 200 µl mẫu máu của bệnh nhân được tách theo kit của Qiagen như đã giới thiệu ở mục 2.2.1.1, chế phẩm ADN tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (hình 3.1) cho thấy các chế phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng ADN rõ nét, độ sáng cao, chứng tỏ ADN tổng số tách được đều nguyên vẹn, không bị đứt gãy.