3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-
3.3.1. Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR trực tiếp
Sản phẩm PCR của đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342- 8582 được cài vào vector PTZ57R/T nhờ enzyme ADN T4-ligase. Các vector tái tổ hợp sau đó được sử dụng cho các thí nghiệm biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Cấy trải tế bào sau biến nạp trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin, X-gal, IPTG với nồng độ thích hợp, ni trong tủ ấm 37oC, sau 12h-14h sẽ có khuẩn lạc xuất hiện (Hình 3.4). Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có màu trắng.
Chọn ngẫu nhiên 5 khuẩn lạc trắng ở mỗi đĩa để làm khuôn cho PCR colony với các cặp mồi LHTC Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 14455-14578), MRTC Fw/Rv (cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen 8166-8385), MRAG Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 8155-8366), MRGA Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 8342-8582) và M13 Fw/Rv (cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự trên vector PTZ57R/T) để sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn gen nhân dòng.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.3. Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455- 14578, 8155-8366, 8166-8385 và 8342-8582
Khuẩn lạc chứa vector mang đoạn gen 14455-14578 (A), đoạn gen 8342-8582 (B) Khuẩn lạc chứa vector mang đoạn gen 8155-8366 (C), đoạn gen 8166-8385 (D)
Theo tính tốn lí thuyết, sử dụng khuẩn lạc mang đoạn gen 14455-14578 làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi LHTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 124bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv là cặp mồi bắt đặc hiệu với trình tự trên vector PTZ57R/T, khoảng cách giữa 2 mồi khơng có đoạn chèn là 155bp nên cho sản phẩm PCR có kích thước là 279bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8155-8366 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRAG Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 212bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 367bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8166-8385 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 220bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 375bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8342-8582 khi được PCR với mồi MRGA Fw/Rv sẽ cho sản phẩm có kích thước 241bp và PCR với mồi M13 Fw/Rv cho sản phầm kích thước 296bp.
Dưới đây là hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ các cặp mồi trên (Hình 3.5).
(C) (D)
Hình 3.4-1. Sản phẩm PCR với các cặp mồi đoạn chèn LHTC, MRAGvà mồi vector M13 của các đoạn gen 14455-14578 (A, B); 8155-8366 (C, D)
(E) (F)
(G) (H)
Hình 3.4-2. Sản phẩm PCR với các cặp mồi đoạn chèn MRTC, MRGA và mồi vector M13 của các đoạn gen 8166-8385 (E, F); 8342-8582 (G, H)
M: marker 100bp, 1: Đối chứng âm; 2- 6: sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc
Kết quả điện di cho thấy, tất cả các băng đều đúng như tính tốn lý thuyết, chứng tỏ 5 khuẩn lạc được lựa chọn đã mang đoạn gen nhân dòng.