3.4. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C
3.4.4. Tách và kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến
3.4.4.1. Tách plasmid chứa đoạn gen mang đột biến
Lựa chọn ngẫu nhiên 2 trong số 5 khuẩn lạc mang đoạn gen chứa vị trí đột biến mong muốn đem nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung ampiciline với nồng độ thích hợp và sau đó tiến hành tách chiết plasmid.
Plasmid tách chiết được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% với marker 1kb (Hình 3.14). Kết quả điện di thu được cho thấy chúng tôi đã tách chiết thành công các plasmid mang đoạn gen chứa vị trí đột biến mong muốn rồi gửi đi giải trình tự
để một lần nữa khẳng định chắc chắn rằng chúng tôi đã tạo thành công đột biến điểm nhân tạo.
(A) (B) (C) (D)
Hình 3.13. Kết quả tách plasmid mang đoạn gen 14455-14578 (hình A), 8166- 8385 (hình B), 8155-8366 (hình C), 8342-8582 (hình D) chứa các vị trí đột biến
T14484C, A8344G, T8356C, G8363A
M: marker 1kb; 1,2: plasmid mang đoạn gen chứa vị trí đột biến
3.4.4.2. Kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến
Plasmid tách chiết được được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với các cặp mồi LHTC, MRTC, MRAG, MRGA đặc hiệu cho các đoạn gen 14455-14578, 8166-8385, 8155-8366, 8342-8582 và cặp mồi M13 đặc hiệu cho vector.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tách chiết với các cặp mồi LHTC, MRTC, MRAG, MRGA và M13
(A): Khuôn là plasmid mang đoạn gen 14455-14578 (B): Khuôn là plasmid mang đoạn gen 8166-8385 (C): Khuôn là plasmid mang đoạn gen 8155-8366 (D): Khuôn là plasmid mang đoạn gen 8342-8582
M: marker 100bp; 1,4: đối chứng âm của phản ứng PCR với mồi đoạn chèn và mồi vector; 2,3: sản phẩm PCR với mồi đoạn chèn; 5,6: sản phẩm PCR với mồi vector.
Kết quả (hình 3.15) cho thấy các băng đều đúng như tính tốn lý thuyết, phù hợp với kết quả trong bước kiểm tra khuẩn lạc, một lần nữa khẳng định rằng chúng tôi đã tách chiết và tinh sạch được plasmid chứa đoạn gen đột biến.
3.4.5. Giải trình tự các plasmid chứa đoạn gen mang đột biến
Các plasmid chứa đoạn gen mang các vị trí đột biến mong muốn sau khi tinh sạch được gửi đi giải trình tự để khẳng định kết quả một cách chắc chắn. Kết quả giải trình tự thu được đem so sánh với trình tự plasmid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu mã NC_012920.1.
3.4.5.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578 có chứa vị trí đột biến T14484C
Khi so sánh trình tự đoạn gen 14455-14578 đã tạo được đột biến nhân tạo với trình tự đoạn gen này trước khi tạo đột biến và trình tự gen mã NC_012920.1 trên ngân hàng gen thế giới (hình 3.16), chúng tơi nhận thấy có sự sai khác tại vị trí 14484, biến đổi T thành C, chứng tỏ chúng tôi đã tạo thành công đột biến T14484C.
(A) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến
Query: trình tự plasmid trước khi tạo đột biến Sbjct: Trình tự plasmid sau khi tạo đột biến
(B) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến vớitrình tự gen mã NC_012920.1
Query: trình tự gen mã NC_012920.1 Sbjct: Trình tự plamid sau khi tạo đột biến
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 14455-14578 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham
Hình 3.16. Một phần trình tự tạo đột biến T14484C
3.4.5.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366 có chứa vị trí đột biến A8344G
(A) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến
Query: trình tự plasmid trước khi tạo ĐB - Sbjct: Trình tự plasmid sau khi tạo đột biến
(B) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến với trình tự gen mã NC_012920.1
Query: trình tự gen mã NC_012920.1 - Sbjct: Trình tự plamid sau khi tạo đột biến
Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8155-8366 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham
Khi so sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 sau khi tạo đột biến với trình tự đoạn gen trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1 trên ngân hàng gen, chúng tôi nhận thấy có sự sai khác tại vị trị 8344, biến A thành G, chứng tỏ chúng tôi đã tạo thành cơng đột biến A8344G.
Hình 3.18. Một phần trình tự tạo đột biến A8344G
3.4.5.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 có chứa vị trí đột biến T8356C
(A) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến
(B) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến với trình tự gen mã NC_012920.1
Query: trình tự gen mã NC_012920.1 - Sbjct: Trình tự plamid sau khi tạo đột biến
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8166-8385 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham
chiếu NC_012920.1
Trên hình 3.20 là kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến chứa đoạn gen 8166-8385 với trình tự plasmid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1, chúng tơi thấy có sự sai khác tại vị trí 8356, thay thế T thành C. Chứng tỏ, chúng tôi đã tạo thành công đột biến điểm T8356C. Dưới đây là một phần kết quả giải trình tự đoạn gen chứa đột biến T8356C (Hình 3.21)
3.4.5.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582 có chứa vị trí đột biến G8363A
(A) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến
Query: trình tự plasmid trước khi tạo đột biến - Sbjct: Trình tự plasmid sau khi tạo đột biến
(B) Kết quả so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến với trình tự gen mã NC_012920.1
Query: trình tự gen mã NC_012920.1 - Sbjct: Trình tự plamid sau khi tạo đột biến
Hình 3.21. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8342-8582 sau khi tạo đột biến với trình tự plamid trƣớc khi tạo đột biến và trình tự gen tham
Hình 3.22. Một phần trình tự tạo đột biến G8363A
Sau khi so sánh trình tự plasmid sau khi tạo đột biến chứa đoạn gen 8342- 8582 với trình tự plasmid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu NC_012920.1, chúng tôi thấy có sự sai khác tại vị trí 8363, biến đổi G thành A. Chứng tỏ, chúng tôi đã tạo thành cơng đột biến điểm G8363A (Hình 3.22).
Trên hình 3.23 là một phần kết quả giải trình tự đoạn gen chứa đột biến G8363A.
Từ những kết quả trên cho thấy, chúng tôi đã tạo thành công 4 đột biến điểm T14484C, A8344G, T8356C, G8363A sử dụng làm đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc các đột biến này từ mẫu ADN ty thể của người bệnh.
3.5. Khẳng định sự có mặt của các đột biến A8344G, T8356C, G8353A, T14484C bằng PCR-RFLP T14484C bằng PCR-RFLP
Sau khi các mẫu đối chứng chuẩn là đoạn ADN bình thường và ADN mang đột biến được tạo ra, chúng tôi tiến hành khảo sát sự có mặt của cả 4 đột biến A8344G, T8356C, G8353A, T14484C trên 128 mẫu ADN tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi của các bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể bằng kĩ thuật PCR-RFLP.
Các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 sau khi được nhân bản bằng kĩ thuật PCR như đã được mô tả ở phần 2.2.2 và sản phẩm PCR mỗi loại sau đó được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% cho kết quả tốt (được trình bày ở phần 3.2) sẽ được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn thích hợp tương ứng (bảng 2.4). Phản ứng cắt được thực hiện với các thành phần như trong bảng 2.5, hỗn hợp phản ứng được giữ ở 370C, từ 10-12 giờ. Sản phẩm cắt được điện di trên gel
polyacrylamide 12% và agarose 2%, đột biến được phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại.
3.5.1. Sàng lọc đột biến T14484C
Trong quá trình sàng lọc, đột biến T14484C làm mất điểm cắt của enzyme giới hạn Sau3AI, do vậy, nếu mẫu nào mang đột biến T14484C thì sẽ khơng bị cắt bởi enzyme Sau3AI và giữ ngun kích thước là 124bp.
Mẫu ADN khơng có chứa đột biến T14484C sẽ bị cắt bởi enzyme giới hạn
Sau3AI thành 2 băng có kích thước 97bp và 27bp. Sản phẩm cắt enzyme giới hạn
được điện di trên gel agarose 2% và đột biến được phát hiện dựa vào phổ băng ADN dưới ánh sáng của tia tử ngoại.
Hình 3.23. Điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 14455-14578 của các mẫu bệnh phẩm
M: marker 100bp, ĐC: mẫu đối chứng dương, 1,2,3,4,5,6,7: sản phẩm PCR-RFLP từ các mẫu ADN của bệnh nhân
Kết quả điện di trên hình 3.24 cho thấy mẫu đối chứng dương (mang đột biến T14484C nhân tạo) không bị cắt bởi enzyme giới hạn Sau3AI, cho băng kích thước 124bp. Các mẫu ADN không mang đột biến chứa vị trí cắt của enzyme Sau3AI,
enzyme này sẽ nhận biết và cắt thành 2 băng 97bp và 27bp phù hợp với tính tốn lí thuyết.
Kết quả chứng tỏ đã tối ưu được các điều kiện và sử dụng được phương pháp PCR-RFLP để sàng lọc đột biến T14484C trên hệ gen ty thể.
Trong 128 mẫu máu bệnh nhân từ bệnh viện Nhi Trung ương, chúng tôi không phát hiện được mẫu nào có đột biến T14484C bằng phương pháp PCR- RFLP.
3.5.2. Sàng lọc đột biến A8344G
Mẫu ADN mang đột biến A8344G sẽ xuất hiện 3 vị trí cắt của enzyme giới hạn BanII và bị cắt thành 4 băng 99bp, 52bp, 41bp và 20bp. Các mẫu ADN khơng mang đột biến A8344G sẽ 2 có vị trí để enzyme BanII nhận biết và cắt thành 3 băng có kích thước 99bp, 72bp và 41bp. Sản phẩm PCR-RFLP thu được đem điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 12%. Đột biến A8344G được phát hiện dựa trên phổ băng ADN dưới ảnh sáng tia tử ngoại.
Dựa theo kết quả điện di trên hình 3.25 cho thấy mẫu đối chứng dương (mang đột biến A8344G nhân tạo) bị cắt bởi enzyme BanII thành 4 băng kích thước 99bp, 52bp, 41bp và 20bp và mẫu đối chứng âm (mẫu không mang đột biến A8344G) bị cắt bởi enzyme BanII thành 3 băng có kích thước 99bp, 72bp và 41bp, phù hợp với tính tốn lí thuyết. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tối ưu hóa các điều kiện và có thể sử dụng phương pháp PCR-RFLP này để sàng lọc đột biến A8344G trên hệ gen ty thể.
Hình 3.24. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP từ đoạn gen 8155-8366 của các mẫu bệnh phẩm
M: Marker 25bp, 1: Sản phẩm PCR, kích thước 212bp
2: sản phẩm PCR-RFLP của plasmid nhân dịng khơng mang đột biến A8344G 3: Sản phẩm PCR-RFLP của plasmid đối chứng dương
Bằng phương pháp này, chúng tôi đã tiền hành kiểm tra sàng lọc sự có mặt của đột biến A8344G trên 128 mẫu ADN từ các bệnh nhân của bệnh viện Nhi Trung ương, tuy nhiên không phát hiện mẫu nào mang đột biến.
3.5.3. Sàng lọc đột biến T8356C
Mẫu ADN mang đột biến T8356C sẽ khơng có vị trí nhận biết của enzyme giới hạn DraI, do vậy khơng bị cắt bởi enzyme này, giữ ngun kích thước của sản phẩm PCR là 220bp. Với những mẫu không mang đột biến T8356C, enzyme giới hạn DraI sẽ nhận biết và cắt sản phẩm PCR thành 2 băng có kích thước 192bp và 28bp. Sản phẩm PCR-RFLP được điện di trên gel agarose 2% để phát hiện sự có mặt của đột biến T8356C bằng phổ băng ADN dưới ánh sáng tia tử ngoại (hình 3.26).
Kết quả điện di trên hình 3.26 cho thấy, đối chứng dương (mang đột biến T8356C nhân tạo) không bị cắt bởi enzyme giới hạn DraI, có kích thước 220bp.
Với các mẫu ADN không mang đột biến T8356C, sản phẩm PCR bị cắt thành 2 băng có kích thước 192bp và 28bp, đúng như tính tốn lí thuyết. Điều này cho thấy, các điều kiện đã được chúng tơi tối ưu hóa và có thể sử dụng phương pháp này để sàng lọc đột biến T8356C trên hệ gen ty thể.
Hình 3.25. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP từ đoạn gen 8166-8385 của các mẫu bệnh phẩm
M: marker 100bp, ĐC: mẫu đối chứng dương,
Chúng tơi tiến hành kiểm tra sự có mặt của đột biến T8356C trên 128 mẫu ADN từ các bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể của viện Nhi Trung ương, tuy nhiên không phát hiện được đột biến nào.
3.5.4. Sàng lọc đột biến G8363A
Sự có mặt của đột biến G8363A làm mất vị trí nhận biết của enzyme NlaIII, do vậy mẫu ADN mang đột biến này sẽ không bị cắt bởi enzyme giới hạn NlaIII, cho kích thước đúng bằng kích thước sản phẩm PCR, 241bp. Với những mẫu ADN không mang đột biến này, NlaIII sẽ nhận biết và cắt thành 2 băng có kích thước
219bp và 22bp.
Sản phẩm PCR-RFLP được điện di kiểm tra trên gel agarose 2% và phát hiện đột biến G8363A dựa trên phổ băng ADN dưới ánh sáng tia tử ngoại.
Hình 3.26. Kết quả điện di sản phẩm PCR-RFLP đoạn gen 8342-8582 từ các mẫu bệnh phẩm
M: marker 100bp, ĐC: mẫu đối chứng dương,
1,2,3,4,5,6,7,8: sản phẩm PCR-RFLP từ các mẫu ADN của bệnh nhân
Kết quả điện di trên hình 3.27 cho thấy, đối chứng dương (mang đột biến G8363A nhân tạo) khơng bị cắt bởi enzyme giới hạn NlaIII, có kích thước 241bp.
Với các mẫu ADN không mang đột biến G8363A, sản phẩm PCR bị cắt thành 2 băng có kích thước 219bp và 22bp, đúng như tính tốn lí thuyết. Điều này cho thấy,
các điều kiện đã được chúng tơi tối ưu hóa và có thể sử dụng phương pháp này để sàng lọc đột biến G8363A trên hệ gen ty thể.
Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc đột biến G8363A trên 128 mẫu ADN từ các bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể của bệnh viện Nhi Trung ương. Tuy nhiên, chúng tôi chưa phát hiện được mẫu nào mang đột biến này.
Kết luận, 128 mẫu ADN được tách từ máu ngoại vi của các bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể đã được kiểm tra sự có mặt của 4 đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A bằng phương pháp PCR-RFLP đã được tối ưu hóa các điều kiện, tuy nhiên chưa phát hiện được đột biến nào từ những mẫu này.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã nhân bản thành cơng các đoạn gen đích chứa các vị trí đột biến quan tâm từ hệ gen ty thể.
2. Đã nhân dịng thành cơng các plasmid mang đoạn ADN ty thể bình thường và các plasmid mangcác vị trí đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A.
3. Đã khẳng định các vị trí đột biến cần tạo bằng PCR-RFLP và giải trình tự.
4. Đã ứng dụng các đột biến tạo được vào sàng lọc đột biến.
5. Đã phát hiện một số đột biến/đa hình trên trình tự ADN của gen MT-TK bao gồm:
+ 1 mất đoạn 9 nucleotit (ACCCCCTCT): 9bp (del.8704-8712) trên gen MT-TK. + 1 đa hình trên gen MT-TK tại vị trí 8183, T thay thế bởi A.
Kiến nghị
Sử dụng mẫu mang đột biến nhân tạo T14484C, A8344G, T8356C, G8363A để làm đối chứng dương trong sàng lọc mẫu bệnh nghi ngờ mang các đột biến này bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Trương Thị Huệ, Phạm Minh Huệ, Lê Ngọc Yến, Phạm Thị Vân Anh, Ngô Diễm Ngọc, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát hiện mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở một số bệnh nhân nghi hội chứng cơ não”, Tạp chí Sinh học 34 (2), tr. 246-252.
2. Trương Thị Huệ, Nguyễn Văn Liệu, Phạm Vân Anh, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa (2012), “Phát hiện và định lượng đột biến A3243G trong hệ gen ty thể ở hội chứng MELAS”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 10 (3), tr. 421-427.
3. Lê Thị Bích Thảo, Đỗ Quỳnh Hoa, Nguyễn Bích Nhi, Nơng Văn Hải, Phan Văn Chi, Phạm Thị Vân Anh, Ninh Thị Ứng (2004), “Xác định đột biến A3243G trên gen tARNLeu ty thể từ các bệnh nhân mắc bệnh ty thể”, Báo cáo khoa học Hội nghị
khoa học toàn quốc. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, tr.
463-465.
4. Phạm Hùng Vân, Hoàng Hiếu Ngọc và Võ Quang Hồng Điểm (2010), "Các