Thành phần Nồng độ Thể tích (μl) Điều kiện của phản ứng
RE buffer 10X 1
Búng nhẹ và spindown Ủkhoảng 12-16 giờ ở370C Enzym giới hạn (RE) 10u 0,5
Sản phẩm PCR 5
Nước 3,5
Tổng 10
Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 12% và agarose 2%, đột biến được phát hiện dựa vào tính đa hình của các đoạn cắt khi quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại.
2.2.4. Nhân dòng sản phẩm PCR từ khn là ADN bình thường (khơng chứa các đột biến quan tâm)
2.2.4.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5α
Tế bào khả biến E.coli DH5α được chuẩn bị dựa trên quy trình của
Sambrook J và cộng sự.
Tế bào E.coli DH5α được nuôi cấy qua đêm trong 10ml môi trường LB. Sau đó tiến hành cấy chuyển sang 100ml mơi trường LB mới và ni lắc ở 370C. Sau khoảng 1giờ thì tiến hành đo OD lần đầu tiên, cứ 15 phút thì đo một lần. Khi giá trị OD đạt 0,35 thì thu dịch ni cấy và ủ trên đá 10 phút. Sau khi ủ, thực hiện ly tâm 3500 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu cặn rồi nhẹ nhàng hòa tan cặn bằng MgCl2-CaCl2 và ủ trên đá 30 phút. Ly tâm lần hai, thu cặn rồi nhẹ nhàng hòa cặn bằng CaCl2 0,1M. Ủ trên đá khoảng 30 phút rồi chia dung dịch trên vào các ống eppendorf, mỗi ống chứa 100µl và bảo quản ở - 800C cho đến khi sử dụng.
2.2.4.2. Phản ứng gắn các đoạn ADN đã được nhân bản bằng PCR vào vector PTZ57R/T PTZ57R/T
Trong nghiên cứu này, để thực hiện cài các đoạn ADN đã được nhân bản bằng PCR vào vector, chúng tôi sử dụng bộ InsTAclone PCR Cloning Kit do hãng Thermo sản xuất.
Nguyên lí: PCR Cloning Kit cho phép nhân dòng sản phẩm PCR được tổng
hợp bởi taq polymerase mà không cần thêm bất cứ một xử lý nào sau phản ứng
PCR. Kit này sử dụng vector PTZ57R/T được thiết kế đặc biệt (như trong hình 2.2). Vector đã được cắt trước bằng Eco32I (một loại isoschizomer của EcoRV) và xử lý với terminal deoxynucleotidyl transferase để tạo ra đầu dính 3’-ddT ở cả 2 đầu cắt.Sản phẩm PCR với đầu 3’- dA nhô ra được cài trực tiếp vào vector tạo ra một phân tử vòng với 2 khe hở. Ngồi ra, nucleotit dT nhơ ra ở đầu cắt ngăn cản việc vector tự đóng vịng trong q trình cài đoạn chèn do đó nâng hiệu suất tái tổ hợp lên đến 90%.
Hình 2.2. Bản đồ vector PTZ57R/T và vị trí đa điểm cắt Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ligase Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ligase
Thành phần Thể tích (µl) Ghi chú
Vector pTZ57R/T 1 -Tỷ lệ đoạn chèn/vector là 3/1 -Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (220C) trong khoảng 1 giờ hoặc ủ qua đêm ở 40C. Bảo quản hỗn hợp
ở -200C cho tới khi biến nạp. 5X ligation buffer 2
Sản phẩm PCR 0,3
Nước 6
T4 ADN ligase 0,7
Tổng thể tích 10
2.2.4.3. Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E. coli khả biến
Để biến nạp plasmid vào tế bào khả biến E. coli DH5α, tế bào khả biến (được xử lý trong điều kiện lạnh và có ion Ca2+, được bảo quản ở - 800C) được lấy ra để trên đá 10-20 phút cho tan dần. Sau đó, 10µl hỗn hợp phản ứng ligase ở trên được bổ sung vào dung dịch tế bào, trộn nhẹ và để trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó được sốc nhiệt ở 420C trong 45 giây và được chuyển ngay lên đá trong 2 phút. Bổ sung 600µl mơi trường LB lỏng đã ủ ấm vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó được ni cấy tĩnh trong tủ ấm ở 370C trong 20 phút và tiếp đến ni lắc ở tốc độ 150 vịng/phút, 370C trong 60 phút để phục hồi các tế
bào sau khi bị sốc nhiệt. 50-100µl hỗn hợp biến nạp được cấy trải tế bào trên đĩa petri chứa mơi trường LB đặc có chứa ampicillin, IPTG, X-gal với nồng độ thích hợp và ni trong tủ ấm 370C cho đến khi quan sát thấy sự hình thành các khuẩn lạc rõ rệt (thường sau 12- 30 giờ nuôi cấy). Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp sẽ có màu trắng.
Cơ sở để chọn lọc khuẩn lạc: vector PTZ57R/T nguyên bản có chứa gen lacZ mã hóa cho β-galactosidase có khả năng phân giải X-gal thành β-galactose + 5- bromo-4-chloro indolyl. Hợp chất này gặp oxi khơng khí sẽ chuyển thành 5,5’- dibromo-4,4’-dichloro indigo có màu xanh da trời. Do đó, trong mơi trường có cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG thì các khuẩn lạc chứa vector nguyên bản sẽ có màu xanh, cịn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp có gen chèn vào vị trí lacZ nên khơng có màu.
Các khuẩn lạc E. coli DH5α tạo thành được kiểm tra bằng phương pháp PCR trực tiếp với mồi đoạn chèn và mồi vector PTZ57R/T (Mồi M13). Khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp sẽ được chọn lọc và nuôi trong môi trường LB lỏng, chuẩn bị cho bước tách plasmid.
2.2.4.4. Xác định các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp bằng phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
Trong quá trình sàng lọc khuẩn lạc, để xác định được các khuẩn lạc chắc chắn mang vector tái tổ hợp, ta tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi đoạn chèn tương ứng (bảng 2.1) và mồi M13 của vector. Trình tự mồi M13, thành phần phản ứng PCR và kích thước sản phẩm được trình bày ở bảng 2.7 và 2.8.
Bảng 2.7. Trình tự mồi M13
Tên mồi Trình tự
M13 Fw 5’ GTAAAACGACGGCCAGT 3’(từ nucleotide 599-614)
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR với mồi M13 Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μl) Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μl) Khn 1 dNTPs 2 mM 2,5 Taqbuffer (+ MgCl2) 10 X 2,5 Taq polymerase 1u 1 Mồi xuôi 10 pM 1 Mồi ngược 10 pM 1 Nước 16
Bảng 2.9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với mồi M13
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
Biến tính mẫu 940C 5 phút Giãn xoắn 35 chu kỳ 940C 30 giây Gắn mồi 480C 30 giây Kéo dài mạch 720C 1 phút
Chu kì kéo dài cuối cùng 720C 5 phút
Bảo quản mẫu 40C + ∞
Với thành phần và chu trình nhiệt như trên (bảng 2.9), sản phẩm PCR thu được theo tính tốn lí thuyết sẽ có kích thước như trong bảng 2.10 khi điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
Bảng 2.10. Kích thƣớc sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi đoạn chèn và mồi vector M13 của các loại đột biến
Loại đột biến Kích thước sản phẩm PCR với mồi đoạn chèn
Kích thước sản phẩm PCR với mồi vector (M13)
A8344G 212bp 367bp
T8356C 220bp 375bp
G8363A 241bp 396bp
2.2.4.5. Tách chiết plasmid
Sau khi chọn lọc được các khuẩn lạc mang gen đã vector tái tổ hợp, tiến hành nuôi các khuẩn lạc này trong môi trường LB lỏng có bổ sung Ampicillin để chuẩn bị tách ADN plasmid. ADN plasmid được tách chiết theo quy trình của“GE Healthcare plasmid miniprep kit”.
Quy trình thực hiện như sau: dịch tế bào nuôi cấy từ các khuẩn lạc được ly tâm nhẹ 8000 vòng/phút trong 30s để thu cặn tế bào. Thực hiện thu khoảng 5ml dịch tế bào. Sau đó ly tâm khơ để loại bỏ hồn tồn dịch nổi. Bổ sung 175µl lysis buffer type 7 và nhẹ nhàng hịa tan cặn tế bào. Bổ sung tiếp theo 175µl lysis buffer type 8, đảo nhẹ để trộn đều dung dịch. Thêm 350µl lysis buffer type 9, đảo nhẹ. Sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 4 phút ở 40C, chuyển dịch nổi sang mini column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C, loại bỏ dịch dưới. Tiếp đó, bổ sung 400µl wash buffer type 1, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C. Chuyển mini column sang ống eppendorf 1.5ml, bổ sung 100µl Elution buffer type 4 rồi để yên trong 30 giây ở nhiệt độ phòng. Ly tâm hỗn hợp 13000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C để thu dịch chứa ADN plasmid trong ống eppendorf. Bảo quản plasmid ở - 200C.
Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agarose 1%, marker 1kb.
2.2.4.6. Giải trình tự các plasmid nhân dòng
Các plasmid nhân dòng chứa các đoạn ADN từ nucleotit 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 của ADN ty thể được tinh sạch và gửi đi giải trình tự để khẳng định chắc chắn kết quả và làm cơ sở thiết kế mồi tạo đối chứng dương tiếp theo.
2.2.5. Thiết kế đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc
Để thiết lập quy trình sàng lọc đột biến điểm là thay thế nucleotit bằng RFLP- PCR, các mẫu đối chứng chuẩn là đoạn ADN bình thường và ADN mang đột biến là cần thiết được tạo ra. Nghiên cứu này áp dụng phương pháp tạo đột biến điểm định hướng bằng PCR đảo (Invert PCR) để tạo các trình tự ADN mang các đột biến A8344G, T8356C và G8363A trên gen MT-TK và đột biến T14484C trên gen ND6.
Hình 2.3. Quy trình tạo đột biến điểm định hƣớng
2.2.5.1. Thiết kế mồi tạo đột biến điểm định hướng
Dựa vào trình tự các đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342- 8582 đã được nhân dịng và giải trình tự, chúng tơi thiết kế cặp mồi chứa điểm đột biến. Mồi được thiết kế theo kiểu bắt cặp khơng hồn tồn với trình tự gen đích ở vị trí đột biến điểm và được photphoryl hóa ở đầu 5’ (bảng 2.11) để làm phản ứng nối hai đầu plasmid đích ở dạng thẳng (hình 2.4).
Bảng 2.11. Trình tự mồi oligonucleotit cho PCR tạo đột biến định hƣớng. Đột biến đƣợc tạo Tên mồi Trình tự nucleotide Kích thƣớc sản phầm PCR A8344G MRG Fw 5’P-ATTAAGAGAGCCCACACCTCTTTAC -3’ 3098bp MRG Rv 5’P- CTTTAACTTAAAAGGTTAATGCTAAAGTTAGC- 3’ T8356C MRC Fw 5’P-CAACACCTCTCTTAAGTGAAATGCC-3’; 3106bp MRC Rv 5’P- GTTCTCTTAATCTTTAACTTAAAAGGTTAATGC- 3’ G8363A MRA Fw
5’P- CTC TTT ACC ATA AAA TGC CCC -3’;
3127bp MRA Rv 5’P- GTG TTG GTT CTC ATC TTC TAG -3’. T14484 C LHC Fw
5’P-CAA AGA CAA CGA CCA TTC CCC C -3’
3010bp LHC
Rv
5’P-GAT ATA CTA CAG CGA TGA ATC GGC C-3’
Các nucleotide gạch chân là các nucleotide được thay đổi tại vị trí cần tạo đột biến.
2.2.5.2. PCR plasmid chứa các đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng
Trong nghiên cứu này, các đột biến điểm được định hướng tạo ra bằng phương pháp PCR đảo (Invert PCR), sử dụng bộ Kit Phusion Site-Directed Mutagenesis® của hãng Thermo.Các phản ứng PCR được tiến hành với ADNkhuôn
là vector tái tổ hợpđược tạo ở trên và đã tối ưu hóa nồng độ với các cặp mồi khác nhau(MRGFw/Rv; MRCFw/Rv và MRAFw/Rv, LHCFw/Rv – có trình tự như trên bảng 2.11). Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.12 và 2.13 chạy trong 25 chu kì. Sản phẩm thu được được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker 1kb.
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR plasmid nhân dịng với mồi chứa vị trí đột biến Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μl) Khn ADN 1 Buffer HF (+Mg 2+) 10X 5 dNTPs 10mM 0.5 Forward primer 10pM 1 Reverse primer 10pM 1
Hot Taq polymerase 5U/µl 0.25
DDW 16.25
Tổng thể tích 25
Bảng 2.13. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với từng loại mồi chứavị trí đột biến Loại đột biến Cặp mồi Chu trình nhiệt (30CK)
T14484C LHC 98oC : 10 giây 66oC : 20 giây 72oC : 2 phút A8344G MRG 98oC : 10 giây 65oC : 20 giây 72oC : 2 phút T8356C MRC 98oC : 10 giây 60oC : 20 giây 72oC : 2 phút G8363A MRA 98oC : 10 giây 56oC : 20 giây 72oC : 2 phút
2.2.5.3. Đóng vịng sản phẩm PCR sử dụng T4-ligase
Sản phẩm PCR là plasmid dạng thẳng được đóng vịng nhờ phản ứng nối bằng enzyme T4-ligase. Thành phần phản ứng được thể hiện trong bảng 2.14.
Bảng 2.14. Thành phần phản ứng đóng vịng sản phẩm PCR Thành phần Thể tích (μl) Điều kiện của phản ứng Thành phần Thể tích (μl) Điều kiện của phản ứng
5X Rapid Ligation Buffer 2
Trộn đều và ủ ở 250C trong 5 phút rồi giữ ở -200C đến khi biến nạp
T4 ADN ligase 0.5
Sản phẩm PCR 1
DDW 6.5
Tổng thể tích 10
2.2.5.4. Biến nạp plasmid đã được đóng vịng vào tế bào khả biến E. coli DH5α và tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến
Hỗn hợp plasmid đã được đóng vịng được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo quy trình được trình bày ở mục 2.2.4.3 rồi sau đó cấy trải trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin thích hợp. PCR trực tiếp chọn lọc các dịng mang plasmid tái tổ hợp, mặc dù đã tối ưu nồng độ khn nhưng vẫn có thể có một lượng plasmid khn dư được biến nạp cùng vì vậy cần tiến hành cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để sàng lọc những dòng mang đoạn gen đã được gây đột biến.
Chọn lọc những khuẩn lạc chứa plasmid mang đoạn gen đột biến đem ni lỏng trong mơi trường LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Tách plasmid và điện di trên gel agarose 1%. PCR kiểm tra plasmid với các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen và mồi M13 Fw/Rv là mồi đặc hiệu cho vector và giải trình tự để khẳng định kết quả.
2.2.6. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm. G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm.
Bằng kĩ thuật PCR-RFLP được trình bày ở trên cùng với các mẫu đối chứng chuẩn là các ADN bình thường và các ADN mang đột biến được tạo ra theo quy trình ở phần 2.2.4 và 2.2.5, chúng tơi đã kiểm tra sự có mặt của cả 4 loại đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A trên 128 mẫu bệnh phẩm do bệnh viên Nhi
Trung ương cung cấp. Những mẫu này được lấy từ những bệnh nhân được nghi ngờ mắc các bệnh ty thể.
2.2.7. Điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Các phân tử ADN là các polyanion nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử ADN trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước của chúng và nồng độ gel. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử có kích thước lớn.
Gel agarose 2% được chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt ADN bởi nuclease. Mẫu ADN được trộn với đệm mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và tra vào các giếng trên gel. Quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra ngâm dưới ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 µg/µl 5-7 phút và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh gel. Phương pháp quan sát ADN trong gel agarose thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của acid nucleic và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.
2.2.8. Điện di trên gel polyacrylamide
Gel polyacrylamide được trùng hợp từ acrylamide và bis-acrylamide cùng với ammonium persulphate và TEMED. Phản ứng trùng hợp chuỗi được bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được trùng hợp thành một chuỗi dài. Khi bis- acrylamide được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Kích thước lỗ gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa. Gel polyacrylamide 12% được tổng hợp với các thành phần như trong bảng 2.15.
Bảng 2.15. Thành phần trong bản gel polyacrylamide STT Thành phần Thể tích STT Thành phần Thể tích 1 Dung dịch acrylamide 30% 2 ml 2 TBE 5X 1 ml 3 APS 10% 35 µl 4 TEMED 3,5 µl 5 Nước cất khử trùng 1,965 ml Tổng thể tích 5 ml
Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn