3.4. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C
3.4.2. Đóng vịng plasmid dạng thẳng và kiểm tra kết quả biến nạp
Sản phẩm PCR từ khuôn là các plasmid mang vector tái tổ hợp với các cặp mồi tạo đột biến điểm thu được ở dạng phân tử mạch thẳng. Sau đó, mỗi sản phẩm này được nối 2 đầu nhờ T4-ligase rồi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α, sau đó cấy trải trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin thích hợp, ni trong tủ ấm sau 12-14h có khuẩn lạc xuất hiện.
Lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc và tiến hành PCR trực tiếp để kiểm tra, sử dụng cặp mồi đoạn chèn và mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự vector.
Theo tính tốn lí thuyết, nếu khuẩn lạc sử dụng làm khuôn mang đoạn gen 14455-14578, khi PCR với cặp mồi LHTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 124bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm PCR có kích thước là 279bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8155-8366 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRAG Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 212bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 367bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8166-8385 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 220bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 375bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8342-8582 khi được PCR với mồi MRGA Fw/Rv sẽ cho sản phẩm có kích thước 241bp và PCR với mồi M13 Fw/Rv cho sản phầm kích thước 396bp.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc được thể hiện dưới hình 3.12.
(A)
(B)
(C)
(D)
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra các khuẩn lạc
M: marker 100bp (100bp plus); 1: đối chứng âm;2,3,4,5,6: sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc (A): sản phẩm PCR với mồi LHTC và M13; (B): sản phẩm PCR với mồi MRTC và M13 (C): Sản phẩm PCR với mồi MRAG và M13;(D): sản phẩm PCR với mồi MRGA và M13
Kết quả điện di trên hình 3.12 cho thấy tất cả các phổ băng ADN khi điện di đều đúng như tính tốn lý thuyết chứng tỏ rằng những khuẩn lạc được ngẫu nhiên lựa chọn đã mang plasmid tái tổ hợp.