1: Thang chuẩn ADN 1kb, 2: Đối chứng âm 3-7: ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân
Đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của chế phẩm ADN tổng số từ 128 mẫu bệnh nhân để đánh giá độ tinh sạch cũng như xác định hàm lượng ADN. Kết quả thu được cho thấy các mẫu ADN đều có tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8- 2,0, chứng tỏ chế phẩm ít lẫn protein hay ARN. Hàm lượng ADN trung bình đạt 30,3 ng/µl. Như vậy, các sản phẩm ADN tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quả nhân bản bằng PCR các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582. 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582.
các cặp mồi đã được kế thừa một cách phù hợp để khuếch đại đặc hiệu vùng gen chứa đột biến cần nghiên cứu (bảng 2.1). Bằng kinh nghiệm thực tế và dựa vào Tmcủa từng mồi, chúng tôi đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện và thành phần của phản ứng PCR (bảng 2.2 và 2.3) để nhân bản thành cơng các đoạn gen chứa vị trí đột biến quan tâm.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 14455-14578 (A) (ND6), 8155-8366 (B), 8166-8385 (C), 8342-8582 (D) (MT-TK)
M: marker 100bp (-): đối chứng âm
1- 8: sản phẩm PCR từ các mẫu ADN tổng số của bệnh nhân
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (hình 3.2) cho thấy sản phẩm ADN nhân bản của mỗi đoạn gen nghiên cứu có kích thước như tính tốn: đoạn gen 8155-8366 cho băng kích thước 212bp, đoạn gen 8166-8385 cho băng 220bp, đoạn gen 8342-8582 cho băng 241bp, đoạn gen 14455-14578 cho băng 124bp. Chứng tỏ việc sử dụng cặp mồi đã thiết kế cho phép nhân bản thành công các đoạn ADN đặc hiệu chứa vị trí đột biến xác định A8344G, T8356C, G8353A, T14484C từ mẫu máu của các bệnh nhân, làm tiền đề cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T
3.3.1. Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR trực tiếp
Sản phẩm PCR của đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342- 8582 được cài vào vector PTZ57R/T nhờ enzyme ADN T4-ligase. Các vector tái tổ hợp sau đó được sử dụng cho các thí nghiệm biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Cấy trải tế bào sau biến nạp trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin, X-gal, IPTG với nồng độ thích hợp, ni trong tủ ấm 37oC, sau 12h-14h sẽ có khuẩn lạc xuất hiện (Hình 3.4). Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có màu trắng.
Chọn ngẫu nhiên 5 khuẩn lạc trắng ở mỗi đĩa để làm khuôn cho PCR colony với các cặp mồi LHTC Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 14455-14578), MRTC Fw/Rv (cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen 8166-8385), MRAG Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 8155-8366), MRGA Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 8342-8582) và M13 Fw/Rv (cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự trên vector PTZ57R/T) để sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn gen nhân dòng.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.3. Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455- 14578, 8155-8366, 8166-8385 và 8342-8582
Khuẩn lạc chứa vector mang đoạn gen 14455-14578 (A), đoạn gen 8342-8582 (B) Khuẩn lạc chứa vector mang đoạn gen 8155-8366 (C), đoạn gen 8166-8385 (D)
Theo tính tốn lí thuyết, sử dụng khuẩn lạc mang đoạn gen 14455-14578 làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi LHTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 124bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv là cặp mồi bắt đặc hiệu với trình tự trên vector PTZ57R/T, khoảng cách giữa 2 mồi khơng có đoạn chèn là 155bp nên cho sản phẩm PCR có kích thước là 279bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8155-8366 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRAG Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 212bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 367bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8166-8385 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 220bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 375bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8342-8582 khi được PCR với mồi MRGA Fw/Rv sẽ cho sản phẩm có kích thước 241bp và PCR với mồi M13 Fw/Rv cho sản phầm kích thước 296bp.
Dưới đây là hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ các cặp mồi trên (Hình 3.5).
(C) (D)
Hình 3.4-1. Sản phẩm PCR với các cặp mồi đoạn chèn LHTC, MRAGvà mồi vector M13 của các đoạn gen 14455-14578 (A, B); 8155-8366 (C, D)
(E) (F)
(G) (H)
Hình 3.4-2. Sản phẩm PCR với các cặp mồi đoạn chèn MRTC, MRGA và mồi vector M13 của các đoạn gen 8166-8385 (E, F); 8342-8582 (G, H)
M: marker 100bp, 1: Đối chứng âm; 2- 6: sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc
Kết quả điện di cho thấy, tất cả các băng đều đúng như tính tốn lý thuyết, chứng tỏ 5 khuẩn lạc được lựa chọn đã mang đoạn gen nhân dòng.
3.3.2. Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen nhân dòng
Sau khi PCR trực tiếp 5 khuẩn lạc ngẫu nhiên, tất cả đều mang đoạn gen cần nhân dịng, chúng tơi lựa chọn 2 khuẩn lạc đem nuôi lỏng trong 5ml LB có bổ sung Ampicilin nồng độ thích hợp, ở 370C, qua đêm. Sau đó thu dịch ni cấy và tiến hành tách chiết plasmid theo quy trình đã trình bày ở mục 2.2.4.5.
Sản phẩm tách chiết được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn ADN 1Kb. Dưới hình 3.6 là kết quả tách chiết ADN plasmid từ các khuẩn lạc mang đoạn gen nhân dòng.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.5. Kết quả tách chiết plasmid nhân dòng
M: marker 1kb; 1: plasmid chưa mang đoạn chèn; 2,3: plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455-14578 (A), 8155-8366 (B), 8166-8385 (C), 8342-8582 (D)
Kết quả điện di cho thấy hầu hết ở các giếng đều có 2 hoặc 3 băng, do đây là các dạng tồn tại khác nhau (vòng, thẳng, siêu xoắn) của plasmid đã tách được. Và ta thấy kích thước của các plasmid tách được từ các khuẩn lạc tái tổ hợp có kích thước lớn hơn kích thước của plasmid khơng mang đoạn chèn. Điều đó chứng tỏ chúng tôi đã tách chiết thành công các plasmid tái tổ hợp. Các plasmid này được tinh sạch rồi gửi đi giải trình tự. Dựa vào trình tự đó để xác định trình tự mồi được thiết kế nhằm mục đích tạo đột biến điểm nhân tạo.
3.3.3. Giải trình tự các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 đã được nhân dòng đã được nhân dòng
Các plasmid mang đoạn gen nhân dòng được tinh sạch và giải trình tự tại hãng 1st Base (Malaysia). Kết quả giải trình tự thu được đem so sánh với trình tự tham chiếu – là trình tự đã được đăng kí trên Genbank với mã số NC_012920.1.
3.3.3.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578
Hình 3.6. So sánh trình tự đoạn gen 14455-14578 nhân dịng với trình tự gen tham chiếu
Query: Trình tự gen mã NC_012920.1 Sbjct: Trình tự đoạn gen nhân dịng
Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 14455-14578 với trình tự chuẩn (Hình 3.6) cho thấy mức độ tương đồng của 2 trình tự là rất cao (~100%), sự sai khác duy nhất tại vị trí 165 C>G là do nhóm nghiên cứu chủ động thay đổi 1 nucleotit trên mồi LHTC Fw, tại vị trí 14482 trên trình tự gen chuẩn để tạo vị trí nhận biết cho enzyme giới hạn Sau3AI.
3.3.3.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366
Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 với trình tự gen chuẩn (Hình 3.7) cho thấy mức độ tương đồng của 2 trình tự này là 99%, xuất hiện 2 vị trí sai khác. Thứ nhất thay thế nucleotit 281 A>C (vị trí 8347 trên trình tự gen chuẩn) là do nhóm nghiên cứu đã chủ động thay đổi 1 nucleotit trên mồi MRAG Rv (T>G) để tạo vị trí nhận biết cho enzyme giới hạn BanII. Vị trí sai khác thứ hai tại vị trí 117 T>A (T8183A trên trình tự gen mã NC_012920.1), đây có thể là một trường hợp do
Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 với trình tự gen tham chiếu
Query: Trình tự gen mã NC_012920.1 Sbjct: trình tự đoạn gen 8155-8366
3.3.3.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 và ngẫu nhiên phát hiện đột biến mất 9bp trên gen MT-TK trên gen MT-TK
Dựa vào kết quả so sánh trên hình 3.8, sự sai khác giữa 2 trình tự tại vị trí 142 C>A (vị trí 8359 trên trình tự gen chuẩn) là do trong quá trình thiết kế mồi MRTC Rv, chúng tôi đã thay thế 1 nucleotit để tạo vị trí nhận biết cho enzyme
DraI. Ngoài ra, chúng tôi đã phát hiện được mất đoạn 9 nucleotit (CCCCCTCTA)
trên gen MT-TK tại vị trí số 182-190 trên trình tự đọc được. Đây là đột biến mất
đoạn 9bp (del.8281-8289) trên gen MT-TK.
Trước đó, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện ra đột biến mất đoạn 9bp ở hệ gen ty thể. Năm 1987 Wrischnik và đồng nghiệp đã phát hiện một đột biến mất đoạn 9bp (CCCCCTCTA) ở một khu vực gen nhỏ khơng có chức năng ghi mã, nằm trong khu vực gen COII/tARNLys. Đây được coi như là một dấu hiệu nhân chủng
Hình 3.8. So sánh trình tự đoạn gen 8166-8385 với trình tự gen tham chiếu
Query: Trình tự gen mã NC_012920.1 Sbjct: Trình tự đoạn gen 8166-8385 nhân dịng
Sau đó, cũng có nhiều nghiên cứu về hiện tượng mất đoạn 9bp này ở hệ gen ty thể. Năm 1999, Ivanova và cộng sự bước đầu đã nghiên cứu đa hình ADN ty thể ở người Việt Nam và phát hiện một số trường hợp mất đoạn 9 bp xảy ra trong khu vực gen COII /tARNLys, tỷ lệ này chiếm 20% ở người khỏe mạnh [22]. Trong nghiên cứu của mình, Yao Y và cộng sự (2000) đã chỉ ra rằng: Hiện tượng mất đoạn 9bp (CCCCCTCTA) ở vùng gen giữa cytochrome oxidase II và tARNLys trong hệ gen ty thể được xem là một dạng đột biến có tỷ lệ cao ở các quần thể người Đông Nam Á [56], nhận định này phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác. Ở Việt Nam, một nghiên cứu đã chỉ ra tỷ lệ này chiếm tới 31,9% trong số 72 bệnh nhân có nghi ngờ mang bệnh ty thể, các đột biến này đều thể hiện tính di truyền theo dòng mẹ và ở dạng đồng nhất. Như vậy tần suất xuất hiện đột biến mất đoạn 9bp giữa vùng gen COII và tARNLys ở các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh cơ não ở người Việt Nam là tương đối cao. Nhưng các nghiên cứu trên đều chưa có nhận định cụ thể về mối liên quan giữa hiện tượng mất đoạn với các triệu chứng bệnh ty thể.
Trong một nghiên cứu của Liu và cộng sự (2005) với các bệnh nhân người Đài Loan có mang hội chứng MELAS hoặc MERRF cho thấy tỷ lệ mất đoạn 9bp là
48% và tỷ lệ này ở người khỏe mạnh là 21% [27]. Tuy nhiên, Varlamov và cộng sự (2002) đã khơng tìm thấy mối tương quan giữa đột biến mất đoạn 9bp ở hệ gen ty thể với với nhóm bệnh ty thể ở dân số Đức [52]. Như vậy, có thể thấy rằng tỷ lệ đột biến mất đoạn 9bp thay đổi tùy thuộc theo các nhóm dân tộc ở các khu vực khác nhau. Kết quả này phản ánh phần nào sự đa hình của hệ gen ty thể người.
Đột biến mất đoạn 9bp có thể được thừa kế cùng với một số các đột biến khác gây bệnh ở người qua các thế hệ và trong q trình tiến hóa của hệ gen ty thể người. Do khơng thuộc vùng gen mã hóa cho protein hoặc ARN vận chuyển, do vậy nó có thể khơng phải là nguyên nhân gây ra bệnh. Tuy nhiên, cần tiến hành các nghiên cứu dịch tễ học phân tử quy mô lớn hơn để thiết lập mối quan hệ giữa đột biến mất đoạn 9bp của mtADN và các hội chứng của bệnh ty thể.
3.3.3.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582
Hình 3.9. So sánh trình tự đoạn gen 8342-8582 với trình tự gen mã NC_012920.1
Query: Trình tự gen mã NC_012920.1 Sbjct: Trình tự đoạn gen 8342-8582 nhân dịng
Kết quả so sánh trình tự trên hình 3.9 cho thấy, sự tương đồng của 2 trình tự này là 99%, sự sai khác tại vị trí 50 A>C và 51 G>A (tương ứng với vị trí 8360 và
8361 trên trình tự gen chuẩn) là do trong q trình thiết kế mồi, chúng tơi chủ động thay thế 2 nucleotit trên mồi MRGA Fw để tạo vị trí nhận biết cho enzyme NlaIII.
Như vậy, chúng tôi đã nhân dịng thành cơng 4 đoạn gen quan tâm để sử dụng cho các mục đích nghiên cứu tiếp theo.
3.4. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C
3.4.1. PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 với 4 cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng 8582 với 4 cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng
Dựa vào trình tự đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 đã được nhân dịng và giải trình tự, chúng tơi tiến hành thiết kế các cặp mồi chứa vị trí đột biến mong muốn (bảng 2.11). Mồi được thiết kế theo kiểu bắt cặp khơng hồn tồn với trình tự gen đích ở vị trí đột biến điểm và được photphoryl hóa ở đầu 5’ để làm phản ứng nối hai đầu plasmid đích ở dạng thẳng.
Với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng được trình bày trong bảng 2.12 và 2.13, sử dụng khuôn ADN là các mẫu plasmid tái tổ hợp đã tạo được ở trên PCR với các cặp mồi tạo đột biến điểm tương ứng, chạy trong 25 chu kì. Sản phẩm PCR thu được điện di trên gel agarose 1% với thang chuẩn ADN 1kb (Hình 3.11).
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến
M: marker 1kb; 5: đối chứng âm
1: sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến LHC, kích thước 3010bp 2: sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến MRG, kích thước 3098bp 3:sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến MRC, kích thước 3106bp 4:sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến MRA, kích thước 3127bp
Dựa vào ảnh điện di hình 3.11 cho thấy, với mỗi phản ứng PCR nhằm tạo mỗi loại đột biến, chúng tôi thu được một băng duy nhất sáng rõ có kích thước khoảng 3,1kb là dạng thẳng của plasmid đích khơng cịn các dạng xoắn khác nhau. Chứng tỏ chúng tôi đã nhân lên thành cơng plasmid đích.
3.4.2. Đóng vịng plasmid dạng thẳng và kiểm tra kết quả biến nạp
Sản phẩm PCR từ khuôn là các plasmid mang vector tái tổ hợp với các cặp mồi tạo đột biến điểm thu được ở dạng phân tử mạch thẳng. Sau đó, mỗi sản phẩm này được nối 2 đầu nhờ T4-ligase rồi biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α, sau đó cấy trải trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin thích hợp, ni trong tủ ấm sau 12-14h có khuẩn lạc xuất hiện.
Lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc và tiến hành PCR trực tiếp để kiểm tra, sử dụng cặp mồi đoạn chèn và mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự vector.
Theo tính tốn lí thuyết, nếu khuẩn lạc sử dụng làm khuôn mang đoạn gen 14455-14578, khi PCR với cặp mồi LHTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 124bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm PCR có kích thước là 279bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8155-8366 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRAG Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 212bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 367bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8166-8385 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi MRTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 220bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv cho sản phẩm kích thước 375bp.
Những khuẩn lạc mang vector chứa đoạn gen 8342-8582 khi được PCR với mồi MRGA Fw/Rv sẽ cho sản phẩm có kích thước 241bp và PCR với mồi M13 Fw/Rv cho sản phầm kích thước 396bp.
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc được thể hiện dưới hình 3.12.
(A)
(B)
(C)
(D)
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra các khuẩn lạc