3.4. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C
3.4.3. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
Trên đĩa cấy trải vi khuẩn đã được biến nạp có thể có những khuẩn lạc mang nhận plasmid chứa đoạn gen có đột biến và có thể có những khuẩn lạc nhận vector mang đoạn gen không chứa đột biến làm khn cho phản ứng PCR ban đầu. Vì vậy chúng tơi tiến hành cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp để sàng lọc những khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến.
Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn kèm theo đối chứng là sản phẩm PCR của mẫu bệnh phẩm khơng đột biến (hình 3.13) cho thấy sản phẩm PCR trực tiếp từ 5 khuẩn lạc với mồi đặc hiệu cho đoạn gen 14455-14578 cho phổ băng bằng với kích thước sản phẩm PCR ban đầu, 124 bp chứng tỏ không bị cắt bởi enzyme giới hạn Sau3AI trong khi sản phẩm PCR không mang đột biến bị cắt thành 2 băng 97 bp và 27bp.
Tương tự với đoạn gen 8166-8385, sản phẩm PCR trực tiếp từ 5 khuẩn lạc với cặp mồi MRTC không bị cắt bởi enzyme giới hạn DraI, cho phổ băng kích
thước 220bp cịn sản phẩm PCR không mang đột biến bị cắt thành 2 băng 192 bp và 28 bp.
Đoạn gen 8342-8582, sản phẩm PCR trực tiếp từ 5 khuẩn lạc với cặp mồi MRGA không bị cắt bởi enzyme giới hạn NlaIII, cho phổ băng kích thước 241bp
trong khi sản phẩm PCR không mang đột biến bị cắt thành 2 băng 219 bp và 22 bp. Với đoạn gen 8155-8366, sản phẩm PCR trực tiếp từ 5 khuẩn lạc với cặp mồi MRAG bị cắt bởi enzyme BanII thành 4 băng có kích thước 99 bp, 52 bp, 41bp, 20 bp, còn sản phẩm PCR không mang đột biến bị cắt thành 3 băng 99 bp, 72 bp và 41bp, đúng như tính tốn lí thuyết.
Như vậy, 5 khuẩn lạc chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên đều mang đoạn gen chứa vị trí đột biến. Điều này có thể do ngay khi thực hiện phản ứng PCR plasmid nhân dịng với mồi đột biến chúng tơi đã tiến hành tối ưu nồng độ khuôn để tránh việc plasmid không mang đột biến được biến nạp cùng plasmid mang đoạn gen đột biến.
(A) M: marker 50bp; 1: sản phẩm PCR (B)M: marker 25bp; 1: đối chứng âm; không mang đột biến; 2,3,4,5,6: sản 2: sản phẩm PCR không mang đột biến phẩm PCR từ plasmid mang đột biến 3,4,5,6,7: sản phẩm PCR từ plasmid mang đột biến
(C) (D)
M: marker 50bp; 1: đối chứng âm phản ứng PCR M: marker 100bp, 1: sản phẩm PCR không 2: sản phẩm PCR không mang đột biến mang đột biến; 2,3,4,5,6: sản phẩm PCR từ 3,4,5,6,7: sản phẩm PCR từ plasmid mang đột biến plasmid mang đột biến
Hình 3.12. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra khuẩn lạc với mồi LHTC (A), MRAG (B), MRTC (C), MRGA (D).