Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
Biến tính mẫu 940C 5 phút Giãn xoắn 35 chu kỳ 940C 30 giây Gắn mồi 480C 30 giây Kéo dài mạch 720C 1 phút
Chu kì kéo dài cuối cùng 720C 5 phút
Bảo quản mẫu 40C + ∞
Với thành phần và chu trình nhiệt như trên (bảng 2.9), sản phẩm PCR thu được theo tính tốn lí thuyết sẽ có kích thước như trong bảng 2.10 khi điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
Bảng 2.10. Kích thƣớc sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi đoạn chèn và mồi vector M13 của các loại đột biến
Loại đột biến Kích thước sản phẩm PCR với mồi đoạn chèn
Kích thước sản phẩm PCR với mồi vector (M13)
A8344G 212bp 367bp
T8356C 220bp 375bp
G8363A 241bp 396bp
2.2.4.5. Tách chiết plasmid
Sau khi chọn lọc được các khuẩn lạc mang gen đã vector tái tổ hợp, tiến hành nuôi các khuẩn lạc này trong mơi trường LB lỏng có bổ sung Ampicillin để chuẩn bị tách ADN plasmid. ADN plasmid được tách chiết theo quy trình của“GE Healthcare plasmid miniprep kit”.
Quy trình thực hiện như sau: dịch tế bào ni cấy từ các khuẩn lạc được ly tâm nhẹ 8000 vòng/phút trong 30s để thu cặn tế bào. Thực hiện thu khoảng 5ml dịch tế bào. Sau đó ly tâm khơ để loại bỏ hồn tồn dịch nổi. Bổ sung 175µl lysis buffer type 7 và nhẹ nhàng hòa tan cặn tế bào. Bổ sung tiếp theo 175µl lysis buffer type 8, đảo nhẹ để trộn đều dung dịch. Thêm 350µl lysis buffer type 9, đảo nhẹ. Sau đó ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 4 phút ở 40C, chuyển dịch nổi sang mini column, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C, loại bỏ dịch dưới. Tiếp đó, bổ sung 400µl wash buffer type 1, ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C. Chuyển mini column sang ống eppendorf 1.5ml, bổ sung 100µl Elution buffer type 4 rồi để yên trong 30 giây ở nhiệt độ phòng. Ly tâm hỗn hợp 13000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C để thu dịch chứa ADN plasmid trong ống eppendorf. Bảo quản plasmid ở - 200C.
Kiểm tra sản phẩm tách chiết bằng điện di trên gel agarose 1%, marker 1kb.
2.2.4.6. Giải trình tự các plasmid nhân dịng
Các plasmid nhân dòng chứa các đoạn ADN từ nucleotit 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 của ADN ty thể được tinh sạch và gửi đi giải trình tự để khẳng định chắc chắn kết quả và làm cơ sở thiết kế mồi tạo đối chứng dương tiếp theo.
2.2.5. Thiết kế đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc
Để thiết lập quy trình sàng lọc đột biến điểm là thay thế nucleotit bằng RFLP- PCR, các mẫu đối chứng chuẩn là đoạn ADN bình thường và ADN mang đột biến là cần thiết được tạo ra. Nghiên cứu này áp dụng phương pháp tạo đột biến điểm định hướng bằng PCR đảo (Invert PCR) để tạo các trình tự ADN mang các đột biến A8344G, T8356C và G8363A trên gen MT-TK và đột biến T14484C trên gen ND6.
Hình 2.3. Quy trình tạo đột biến điểm định hƣớng
2.2.5.1. Thiết kế mồi tạo đột biến điểm định hướng
Dựa vào trình tự các đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342- 8582 đã được nhân dịng và giải trình tự, chúng tơi thiết kế cặp mồi chứa điểm đột biến. Mồi được thiết kế theo kiểu bắt cặp khơng hồn tồn với trình tự gen đích ở vị trí đột biến điểm và được photphoryl hóa ở đầu 5’ (bảng 2.11) để làm phản ứng nối hai đầu plasmid đích ở dạng thẳng (hình 2.4).
Bảng 2.11. Trình tự mồi oligonucleotit cho PCR tạo đột biến định hƣớng. Đột biến đƣợc tạo Tên mồi Trình tự nucleotide Kích thƣớc sản phầm PCR A8344G MRG Fw 5’P-ATTAAGAGAGCCCACACCTCTTTAC -3’ 3098bp MRG Rv 5’P- CTTTAACTTAAAAGGTTAATGCTAAAGTTAGC- 3’ T8356C MRC Fw 5’P-CAACACCTCTCTTAAGTGAAATGCC-3’; 3106bp MRC Rv 5’P- GTTCTCTTAATCTTTAACTTAAAAGGTTAATGC- 3’ G8363A MRA Fw
5’P- CTC TTT ACC ATA AAA TGC CCC -3’;
3127bp MRA Rv 5’P- GTG TTG GTT CTC ATC TTC TAG -3’. T14484 C LHC Fw
5’P-CAA AGA CAA CGA CCA TTC CCC C -3’
3010bp LHC
Rv
5’P-GAT ATA CTA CAG CGA TGA ATC GGC C-3’
Các nucleotide gạch chân là các nucleotide được thay đổi tại vị trí cần tạo đột biến.
2.2.5.2. PCR plasmid chứa các đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385; 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng 8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng
Trong nghiên cứu này, các đột biến điểm được định hướng tạo ra bằng phương pháp PCR đảo (Invert PCR), sử dụng bộ Kit Phusion Site-Directed Mutagenesis® của hãng Thermo.Các phản ứng PCR được tiến hành với ADNkhuôn
là vector tái tổ hợpđược tạo ở trên và đã tối ưu hóa nồng độ với các cặp mồi khác nhau(MRGFw/Rv; MRCFw/Rv và MRAFw/Rv, LHCFw/Rv – có trình tự như trên bảng 2.11). Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt được trình bày ở bảng 2.12 và 2.13 chạy trong 25 chu kì. Sản phẩm thu được được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với marker 1kb.
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR plasmid nhân dịng với mồi chứa vị trí đột biến Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (μl) Khn ADN 1 Buffer HF (+Mg 2+) 10X 5 dNTPs 10mM 0.5 Forward primer 10pM 1 Reverse primer 10pM 1
Hot Taq polymerase 5U/µl 0.25
DDW 16.25
Tổng thể tích 25
Bảng 2.13. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với từng loại mồi chứavị trí đột biến Loại đột biến Cặp mồi Chu trình nhiệt (30CK)
T14484C LHC 98oC : 10 giây 66oC : 20 giây 72oC : 2 phút A8344G MRG 98oC : 10 giây 65oC : 20 giây 72oC : 2 phút T8356C MRC 98oC : 10 giây 60oC : 20 giây 72oC : 2 phút G8363A MRA 98oC : 10 giây 56oC : 20 giây 72oC : 2 phút
2.2.5.3. Đóng vịng sản phẩm PCR sử dụng T4-ligase
Sản phẩm PCR là plasmid dạng thẳng được đóng vịng nhờ phản ứng nối bằng enzyme T4-ligase. Thành phần phản ứng được thể hiện trong bảng 2.14.
Bảng 2.14. Thành phần phản ứng đóng vịng sản phẩm PCR Thành phần Thể tích (μl) Điều kiện của phản ứng Thành phần Thể tích (μl) Điều kiện của phản ứng
5X Rapid Ligation Buffer 2
Trộn đều và ủ ở 250C trong 5 phút rồi giữ ở -200C đến khi biến nạp
T4 ADN ligase 0.5
Sản phẩm PCR 1
DDW 6.5
Tổng thể tích 10
2.2.5.4. Biến nạp plasmid đã được đóng vịng vào tế bào khả biến E. coli DH5α và tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến
Hỗn hợp plasmid đã được đóng vịng được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α theo quy trình được trình bày ở mục 2.2.4.3 rồi sau đó cấy trải trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin thích hợp. PCR trực tiếp chọn lọc các dòng mang plasmid tái tổ hợp, mặc dù đã tối ưu nồng độ khn nhưng vẫn có thể có một lượng plasmid khn dư được biến nạp cùng vì vậy cần tiến hành cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để sàng lọc những dòng mang đoạn gen đã được gây đột biến.
Chọn lọc những khuẩn lạc chứa plasmid mang đoạn gen đột biến đem nuôi lỏng trong mơi trường LB có bổ sung kháng sinh thích hợp. Tách plasmid và điện di trên gel agarose 1%. PCR kiểm tra plasmid với các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen và mồi M13 Fw/Rv là mồi đặc hiệu cho vector và giải trình tự để khẳng định kết quả.
2.2.6. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm. G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm.
Bằng kĩ thuật PCR-RFLP được trình bày ở trên cùng với các mẫu đối chứng chuẩn là các ADN bình thường và các ADN mang đột biến được tạo ra theo quy trình ở phần 2.2.4 và 2.2.5, chúng tơi đã kiểm tra sự có mặt của cả 4 loại đột biến T14484C, A8344G, T8356C, G8363A trên 128 mẫu bệnh phẩm do bệnh viên Nhi
Trung ương cung cấp. Những mẫu này được lấy từ những bệnh nhân được nghi ngờ mắc các bệnh ty thể.
2.2.7. Điện di trên gel agarose
Nguyên tắc: Các phân tử ADN là các polyanion nên trong mơi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử ADN trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước của chúng và nồng độ gel. Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử có kích thước lớn.
Gel agarose 2% được chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt ADN bởi nuclease. Mẫu ADN được trộn với đệm mẫu có chứa glycerol 20%, chất chỉ thị màu bromophenol xanh, xylene cyanol và tra vào các giếng trên gel. Quá trình điện di được thực hiện với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại. Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra ngâm dưới ethidium bromide (EtBr) ở nồng độ 50 µg/µl 5-7 phút và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh gel. Phương pháp quan sát ADN trong gel agarose thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của acid nucleic và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel.
2.2.8. Điện di trên gel polyacrylamide
Gel polyacrylamide được trùng hợp từ acrylamide và bis-acrylamide cùng với ammonium persulphate và TEMED. Phản ứng trùng hợp chuỗi được bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được trùng hợp thành một chuỗi dài. Khi bis- acrylamide được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo để tạo thành dạng gel. Kích thước lỗ gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa. Gel polyacrylamide 12% được tổng hợp với các thành phần như trong bảng 2.15.
Bảng 2.15. Thành phần trong bản gel polyacrylamide STT Thành phần Thể tích STT Thành phần Thể tích 1 Dung dịch acrylamide 30% 2 ml 2 TBE 5X 1 ml 3 APS 10% 35 µl 4 TEMED 3,5 µl 5 Nước cất khử trùng 1,965 ml Tổng thể tích 5 ml
Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn được trộn với đệm mẫu và tra vào đường chạy điện di trong đệm TAE 1X với hiệu điện thế ổn định 10vol/cm gel cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Gel được nhuộm bằng EtBr hịa trong nước, sau khoảng 5 phút, bản gel được lấy ra, rửa dưới vòi nước và soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel, các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.9. Giải trình tự
Các đột biến mtADN được phát hiện bằng PCR-RFLP và được khẳng định lại bằng xác định trình tự gen chứa đột biến.
Nguyên tắc: xác định trình tự dựa theo phương pháp kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide (ddNTP). Khi các ddNTP được gắn vào chuỗi ADN đang tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại (do các nucleotide này chỉ chứa 3’–H thay cho 3’–OH). Như vậy, từ một đoạn ADN ban đầu, nhiều đoạn sợi đơn mới được đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các đoạn này có độ dài khác biệt nhau một nucleotide. Các đoạn sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện di acrylamide dạng maoquản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích kết quả để đưa ra trình tự đoạn ADN gốc.
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kiểm tra ADN tổng số của mẫu bệnh phẩm
Mẫu máu của bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể được cung cấp từ Bệnh viện Nhi Trung ương, sau đó ADN tổng số được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi của các bệnh nhân này. ADN tổng số từ 200 µl mẫu máu của bệnh nhân được tách theo kit của Qiagen như đã giới thiệu ở mục 2.2.1.1, chế phẩm ADN tổng số được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân (hình 3.1) cho thấy các chế phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân đều có một băng ADN rõ nét, độ sáng cao, chứng tỏ ADN tổng số tách được đều ngun vẹn, khơng bị đứt gãy.
Hình 3.1. Điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân
1: Thang chuẩn ADN 1kb, 2: Đối chứng âm 3-7: ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân
Đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại của chế phẩm ADN tổng số từ 128 mẫu bệnh nhân để đánh giá độ tinh sạch cũng như xác định hàm lượng ADN. Kết quả thu được cho thấy các mẫu ADN đều có tỷ số A260/A280 nằm trong khoảng 1,8- 2,0, chứng tỏ chế phẩm ít lẫn protein hay ARN. Hàm lượng ADN trung bình đạt 30,3 ng/µl. Như vậy, các sản phẩm ADN tổng số đạt yêu cầu để tiến hành các bước thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quả nhân bản bằng PCR các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582. 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582.
các cặp mồi đã được kế thừa một cách phù hợp để khuếch đại đặc hiệu vùng gen chứa đột biến cần nghiên cứu (bảng 2.1). Bằng kinh nghiệm thực tế và dựa vào Tmcủa từng mồi, chúng tơi đã tiến hành tối ưu hóa các điều kiện và thành phần của phản ứng PCR (bảng 2.2 và 2.3) để nhân bản thành công các đoạn gen chứa vị trí đột biến quan tâm.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 14455-14578 (A) (ND6), 8155-8366 (B), 8166-8385 (C), 8342-8582 (D) (MT-TK)
M: marker 100bp (-): đối chứng âm
1- 8: sản phẩm PCR từ các mẫu ADN tổng số của bệnh nhân
Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 2% (hình 3.2) cho thấy sản phẩm ADN nhân bản của mỗi đoạn gen nghiên cứu có kích thước như tính tốn: đoạn gen 8155-8366 cho băng kích thước 212bp, đoạn gen 8166-8385 cho băng 220bp, đoạn gen 8342-8582 cho băng 241bp, đoạn gen 14455-14578 cho băng 124bp. Chứng tỏ việc sử dụng cặp mồi đã thiết kế cho phép nhân bản thành công các đoạn ADN đặc hiệu chứa vị trí đột biến xác định A8344G, T8356C, G8353A, T14484C từ mẫu máu của các bệnh nhân, làm tiền đề cho các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582 không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T
3.3.1. Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR trực tiếp
Sản phẩm PCR của đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342- 8582 được cài vào vector PTZ57R/T nhờ enzyme ADN T4-ligase. Các vector tái tổ hợp sau đó được sử dụng cho các thí nghiệm biến nạp vào tế bào E. coli DH5α. Cấy trải tế bào sau biến nạp trên đĩa LB có bổ sung Ampicilin, X-gal, IPTG với nồng độ thích hợp, ni trong tủ ấm 37oC, sau 12h-14h sẽ có khuẩn lạc xuất hiện (Hình 3.4). Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp có màu trắng.
Chọn ngẫu nhiên 5 khuẩn lạc trắng ở mỗi đĩa để làm khuôn cho PCR colony với các cặp mồi LHTC Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 14455-14578), MRTC Fw/Rv (cặp mồi đặc hiệu nhân bản đoạn gen 8166-8385), MRAG Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 8155-8366), MRGA Fw/Rv (cặp mồi nhân bản đặc hiệu đoạn gen 8342-8582) và M13 Fw/Rv (cặp mồi bắt cặp đặc hiệu với trình tự trên vector PTZ57R/T) để sàng lọc các khuẩn lạc mang đoạn gen nhân dòng.
(A) (B)
(C) (D)
Hình 3.3. Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455- 14578, 8155-8366, 8166-8385 và 8342-8582
Khuẩn lạc chứa vector mang đoạn gen 14455-14578 (A), đoạn gen 8342-8582 (B) Khuẩn lạc chứa vector mang đoạn gen 8155-8366 (C), đoạn gen 8166-8385 (D)
Theo tính tốn lí thuyết, sử dụng khuẩn lạc mang đoạn gen 14455-14578 làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi LHTC Fw/Rv cho sản phẩm có kích thước 124bp, với cặp mồi M13 Fw/Rv là cặp mồi bắt đặc hiệu với trình tự trên vector PTZ57R/T, khoảng cách giữa 2 mồi khơng có đoạn chèn là 155bp nên cho sản