CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3. Hệ thống nấm men Pichia pastoris biểu hiện protein ngoại lai
1.3.1. Đặc điểm của hệ thống biểu hiện P pastoris
P. pastoris là vi sinh vật nhân chuẩn dễ ni cấy, có thể sinh trưởng đến mật độ
tế bào cao và các thao tác di truyền đơn giản hơn nhiều so với nuôi cấy tế bào đợng vật. Thêm vào đó, vector biểu hiện mang gen ngoại lai có thể được chèn hiệu quả vào hệ gen của nấm men thơng qua q trình tái tổ hợp giữa các đoạn tương đồng tạo dòng tế bào ổn định để biểu hiện protein ngoại lai.
P. pastoris có hai gen aox1 và aox2 mã hóa cho enzyme alcohol oxidase-AOX.
Gen aox1 chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính AOX của tế bào. Biểu hiện gen aox1
được kiểm soát chặt chẽ và tăng lên nếu nồng độ methanol cao. Với điều kiện ni cấy trong bình lắc thì mức đợ biểu hiện của gen ước tính chiếm khoảng 5% lượng protein hòa tan tổng số và lớn hơn 30% đối với tế bào sinh trưởng trong hệ thống lên men. Gen
aox2 tương đồng tới 97% với aox1, tuy nhiên lại có hoạt tính AOX thấp. Nếu P. pastoris
bị đợt biến gen aox1 (chủng P. pastoris KM71), chỉ còn lại aox2 thì sẽ sinh trưởng chậm trên mơi trường có methanol (chủng MutS). Chủng này được sử dụng để biểu hiện các protein đòi hỏi sự cải biến sâu sắc sau dịch mã. Chủng Mut+ (chủng P. pastoris X33) là chủng dại có cả hai gen aox1 và aox2 nên sẽ sinh trưởng tốt hơn trên mơi trường có
methanol. Do đó, chủng P. pastoris X33 là lựa chọn phù hợp để biểu hiện protein ngoại lai với sản lượng lớn [8, 14, 57]. Mợt ưu điểm nữa là P. pastoris có promoter mạnh cho phép sử dụng methanol như một nguồn năng lượng, tạo điều kiện sản xuất lượng lớn protein đích với kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp hơn hẳn so với các hệ thống biểu hiện nhân chuẩn khác. Cũng nhờ đó, P. pastoris dễ dàng tăng trưởng trong điều kiện môi
này. Sự biểu hiện của protein ngoại lai được kiểm soát bởi promoter AOX1, đồng nghĩa với việc biểu hiện protein được cảm ứng bởi sự bổ sung methanol [12, 42].
Ở chủng P. pastoris, các protein ngoại lai được biểu hiện nợi bào hoặc tiết ra ngồi môi trường. Do các protein nội sinh được sản sinh ở mức độ thấp, môi trường nuôi cấy nấm men không bổ sung thêm các protein nên protein ngoại lai được biểu hiện và tiết ra ngoài sẽ chiếm phần lớn lượng protein tổng số, tạo điều kiện thuận lợi trong việc tinh sạch protein mong muốn. Tuy nhiên, các protein tiết thường được điều khiển bởi tế bào vật chủ nhờ chuỗi trình tự tín hiệu, được xem như trình tự tiết nằm trên protein ngoại lai. Trong mợt số các trình tự tiết khác nhau thì trình tự α-factor nguồn gốc từ S. cerevisiae được sử dụng khá rộng rãi và thành công hiện nay [42,57]. Do đó, các vector biểu hiện sử dụng cho P. pastoris thường mang trình tự tín hiệu này để giúp cho protein tái tổ hợp được tiết ra ngoài môi trường ni cấy. P. pastoris cịn có khả năng thực hiện nhiều biến đổi sau dịch mã bao gồm xử lý các trình tự tín hiệu, c̣n gập, hình thành cầu disulfide và q trình glycosyl hóa liên kết với O và N. Sự glycosyl hóa ở vị trí N trong P. pastoris hầu hết bao gồm chuỗi ManGlcNAc, giống với kiểu glycosyl hóa protein điển hình trong tế bào đợng vật có vú. Mợt ưu điểm khác là ở P. pastoris, các protein tiết có q trình glycosyl hóa vào đầu N nhưng khơng bị glycosyl hóa q mức như ở S. cerevisiae, do đó protein được sản xuất từ P. pastoris có cấu trúc bậc 4 ít bị sai lệch [12].