Chú thích: Giếng M: marker, giếng ĐC: chủng X33/pPICZαA ni trong môi trường BMMY,
giếng YPM, YPDM, MMY, BMM, BMMY: chủng X33/pPICZαA-TAT-p53-His biểu hiện ở các môi trường tương ứng.
Kết quả điện di ở hình 3.10 cho thấy, ở các môi trường YPM, YPDM, MMY, BMM và BMMY đều xuất hiện mợt băng protein kích thước khoảng 47 kDa đúng bằng với kích thước lý thuyết của protein p53 tái tổ hợp đã thiết kế. Chủng X33-36 trong thí nghiệm này ở môi trường YPM lại không xuất hiện băng 57 kDa như kết quả ở mục 3.3.2, như vậy rõ ràng các đầu α-peptide đã được loại bỏ và kết luận trước đó của chúng tôi là phù hợp. Protein biểu hiện mạnh và cho băng điện di đậm nhất ở môi trường BMMY. Như vậy, môi trường BMMY đã được chúng tôi lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu hiện protein tiếp theo. Kết quả này phù hợp với một số kết quả biểu hiện p53 tái tổ hợp đã công bố của nhóm tác giả nhóm Haowei Yan (2012) [25] và Salma Abdelmoula-Souissi (2013) [2].
3.2.3. Tối ưu nồng độ methanol cảm ứng biểu hiện
Trong quá trình biểu hiện, methanol được bổ sung sau mỗi 24 giờ nuôi cấy với vai trò là chất cảm ứng promoter AOX1 kiểm sốt q trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Mức độ biểu hiện p53 khác nhau khi được cảm ứng methanol ở các nồng độ khác nhau. Khảo sát dải nồng độ methanol cảm ứng từ 0,5-2,0%, chúng tôi nhận thấy, khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp X33-36 suy giảm dần khi được nuôi cảm ứng với nồng đợ methanol tăng dần (Hình 3.11).
Hình 3.11. Kết quả sinh trưởng của chủng X33-36 ở các nồng độ methanol
Chú thích: chủng X33* được nuôi ở môi trường BMMY, nồng độ cảm ứng methanol 0,5%;.
chủng X33-36 được nuôi ở môi trường BMMY , nồng độ cảm ứng methanol từ 0,5-2%.
Kết quả điện di trên gel polyacrylamide cho thấy, mức độ biểu hiện protein p53 tái tổ hợp có xu hướng giảm dần khi nồng độ methanol tăng lên, tương ứng với mức độ nhạt của băng protein quan sát được (Hình 3.12). Khả năng biểu hiện p53 tái tổ hợp của chủng X33-36 đạt cực đại ở nồng độ cảm ứng methanol là 0,5% (Giếng 0,5%, Hình 3.12). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của các nhóm Haowei Yan (2012) [25],
Salma Abdelmoula-Souissi (2011, 2012) [1, 2] đã công bố trước đây về việc biểu hiện p53 tái tổ hợp ở nấm men P. pastoris.
Hình 3.12. Kết quả điện di protein từ dịch nuôi cảm ứng với các nồng độ methanol
Chú thích: Giếng M: marker, giếng 0,5% - 2,0%: chủng X33/pPICZαA-TAT-p53-His biểu hiện
p53 ở những nồng độ methanol tương tứng từ 0,5%-2,0%.
3.3. Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp thu được
3.3.1. Tinh sạch protein p53 tái tổ hợp
Sau khi đã lựa chọn được chủng nấm men tái tổ hợp và tối ưu điều kiện biểu hiện p53 tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành sản xuất với thể tích ni cấy lớn hơn là 200 ml môi trường BMMY, nồng độ cảm ứng methanol là 0,5%. Sau 72h ni cấy, tồn bợ dịch nuôi cấy được thu lại, sử dụng cột cô mẫu Pierce™ Protein Concentrator PES 30K MWCO (Thermo) để loại bỏ những protein tạp cịn lại trong dịch ni cấy. Cợt cơ mẫu cho phép loại bỏ các protein có khối lượng nhỏ hơn 30 kDa trơi xuống, trong khi protein p53 tái tổ hợp có khối lượng là 47 kDa, do đó chúng tơi có thể cơ đọng mẫu lại cịn 40ml dịch. Như vậy nồng độ protein trong dịch nuôi cấy đã được cô lại 5 lần. Mẫu cơ sau đó được hịa lại với đệm gắn cợt với tỉ lệ 1:2 để tạo điều kiện cho protein p53 bám tốt lên
cột tinh sạch. Độ sạch của TAT-p53-His được kiểm tra trên gel polyacrylamide 12%, nhuộm CBB và quan sát bằng mắt thường.
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch p53 tái tổ hợp từ dịch ngoại bào
Chú thích: Giếng M: marker, giếng DC: dịch lên cột, giếng FT: dịch trôi qua cột, giếng W: dịch
rửa cột, giếng E5-8: các phân đoạn thu được khi đẩy protein ra khỏi cột.
Kết quả điện di SDS-PAGE (Hình 3.13) cho thấy phân đoạn protein gắn trên cột Niken-Sepharose được rửa chiết ra bằng đệm có chứa imidazol 200 mM có băng 47 kDa của protein p53 tái tổ hợp. Tuy vậy, hiệu suất gắn cợt chưa cao (có băng 47 kDa của p53 tái tổ hợp trong phân đoạn FT qua cột Niken-Sepharose) dẫn đến hiệu suất thu hồi p53 còn bị hao hụt. Để đánh giá mức độ thu hồi protein, chúng tôi tiếp tục tiến hành định lượng protein đã thu được bằng phương pháp Bradford. Kết quả Bradford sẽ giúp chúng tôi thẩm định khả năng biểu hiện protein p53 tái tổ hợp và có thể so sánh hiệu suất với các nhóm nghiên cứu trước đây.
3.3.2. Định lượng protein p53 bằng phương pháp Bradford
Để xác định hiệu suất tinh sạch qua cột Niken-Sapharose, hàm lượng protein trong các dịch mẫu theo các bước tinh sạch được xác định theo phương pháp Bradford (Mục
phút ủ ở nhiệt đợ phịng được chúng tôi sử dụng để xây dựng đường chuẩn Bradford. Chỉ số tin cậy R2 đạt 0,9893 cho thấy đường chuẩn xây dựng được đạt độ tin cậy cao.
Bảng 3.2. Kết quả đo OD595 nm dựng đường chuẩn
mBSA (µg) 0 5 10 20 30 40 50
OD595 nm 0 0.33 0.455 0.617 0.825 0.944 1.077
Đường chuẩn Bradford xây dựng được có phương trình là y = 0.0165x + 0.2806.
Hình 3.14. Đường chuẩn Bradford
Dựa vào phương trình đường chuẩn (Hình 3.14), chúng tôi xác định được nồng độ trong mẫu cần định lượng (X) bằng công thức sau:
X (mg/ml) = (𝑦−0,2806) 0,0165.𝑉
Trong đó, y là giá trị OD595 nm đã đo được ở mẫu, V (µl) là thể tích mẫu đã sử dụng trong phản ứng Bradford. y = 0.0165x + 0.2806 R² = 0.9893 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 10 20 30 40 50 60 OD 595 mBSA(µg)
Với 3 ml dịch cơ được đưa lên cợt, chúng tôi thu lại được 3 ml dịch tinh sạch chứa protein p53 tái tổ hợp và sử dụng để làm mẫu đo trong phản ứng định lượng Bradford. Kết quả đo OD600 nm và nồng độ protein tương ứng được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả Bradford của quá trình tinh sạch
Dịch cô Dịch trôi cột FT TAT-p53-His Hiệu suất (%)
V (µl) 50 150 50 -
OD595 nm 0,758 0,763 0,545 -
Nồng độ (mg/ml) 0,578 0,195 0,321 56
Lượng protein tổng số trong 3ml dịch cô là:
mprotein t ổng số = 0,587 x 3 = 1,734 (mg)
Lượng protein p53 tái tổ hợp thu được trong 3ml dịch tinh sạch là: mp53 = 0,321 x 3 = 0,963 (mg)
Hiệu suất tinh sạch là:
H = mp53 : mprotein t ổng số = 0,963 : 1,734 = 0,56 Với 40ml dịch cô, lượng protein tổng số là:
mprotein tổng số = 40 x 0,578 = 23,12 (mg)
Với hiệu suất H= 0,56, tổng lượng p53 tái tổ hợp thu được từ 40ml dịch cô là: mp53 = 23,12 x 0,56 = 12,95 (mg)
Do vậy, với 200ml môi trường nuôi biểu hiện (tương đương với 40ml dịch cơ) thì nồng đợ p53 tái tổ hợp thu hồi được là 12,95 mg, tương đương với nồng độ của protein
Haowei Yan (2012) [25], chúng tôi nhận thấy khả năng biểu hiện protein p53 tái tổ hợp sau khi cải biến tốt hơn so với nhóm nghiên cứu trước (nhóm Haowei Yan thu được khoảng 104 mg TAT-p53 trong 2L môi trường nuôi cấy, tương đương với nồng độ 0,052mg/ml). Và đồng thời, điều này cũng cho thấy mức độ biểu hiện prorein hòa tan tương đối cao hơn so với mức độ biểu hiện ở sinh vật bậc thấp hơn (khoảng 0,008mg/ml) đã được báo cáo trước đây trong hệ thống biểu hiện prokaryote (Jiang và cộng sự, 2008).
3.4. Xác định protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA
Chúng tôi đã tiến hành nhân bản hai đoạn DNA nằm trên promoter của gen mdm2
bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Mục 2.2.10) trong đó đoạn DNA thứ nhất (p53RE) có kích thước là 187 bp có mang trình tự gắn đặc hiệu của p53 (Phụ lục) và đoạn DNA thứ hai (DCmdm2) có kích thước 200 bp khơng mang trình tự gắn đặc hiệu của p53. Chúng tôi tạo phản ứng bám cho protein p53 tái tổ hợp với trình tự bám đặc hiệu trên promoter của gen mdm2 trong điều kiện in vitro. Theo nguyên tắc, khi phức
hợp protein/DNA được tạo thành, DNA sẽ có trọng lượng nặng hơn. Do đó, khi chạy trong điện trường, các băng DNA có gắn protein sẽ đi chậm hơn so với các băng DNA tự do và không cịn giữ chuẩn kích thước khi so sánh với thang chuẩn marker. Từ kết quả điện di thể hiện trong hình 3.15, chúng tơi nhận thấy phức hợp p53/p53RE đã được tạo thành, do băng ở giếng 2 (Hình 3.15) đã đi chậm hơn so với giếng đối chứng có chứa đoạn DNA p53RE dạng tự do (Giếng 1, Hình 3.15). Do khơng có phản ứng bám giữa
Taq và p53RE nên băng DNA ở giếng 3 (Hình 3.15) vẫn giữa chuẩn kích thước bằng với băng DNA ở giếng đối chứng (Giếng 1, Hình 3.15). Để chứng minh sự bám giữa p53 tái tổ hợp và DNA mục tiêu là đặc hiệu, chúng tôi thực hiện thêm phản ứng tương tác giữa p53 tái tổ hợp với đoạn DCmdm2 (đối chứng mdm2) cũng nằm trên promoter của mdm2 nhưng khơng chứa trình tự bám của p53. Kết quả ở giếng 4 và 5 (Hình 3.15) cho hai băng DNA bằng nhau và có kích thước 200 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của
protein dạng tự nhiên. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của nhóm Arie Zauberman và cộng sự thực hiện năm 1995 [6] với p53 dạng tự nhiên và dạng đột biến. Với những kết quả đã đạt được có thể kết luận protein p53 tái tổ hợp do chúng tôi tổng hợp cũng có hoạt tính sinh học, có thể gắn với DNA như một nhân tố phiên mã – một chức năng quan trọng thiết yếu để ứng dụng p53 tái tổ hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.15. Kết quả điện di khơng biến tính protein p53 tái tổ hợp
Chú thích: Giếng M: marker DNA 100 bp, giếng 1: RE, giếng 2: p53 + p53RE, giếng 3:
KẾT LUẬN
1. Đã tách chiết thành công vector biểu hiện pPICZαA/TAT-p53-His với khối lượng lớn từ chủng vi khuẩn E. coli DH5α với độ tinh sạch cao đạt yêu cầu cho phản ứng biến nạp vào chủng nấm men P. pastoris X33. Cấu trúc biểu hiện
pPICZαA/TAT-p53-His dung hợp vào trong DNA hệ gen của P. pastoris X33
đã được kiểm tra bằng kĩ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
2. Đã lựa chọn chủng X33-36 là chủng biến nạp biểu hiện p53 tái tổ hợp. Môi trường tối ưu để biểu hiện protein p53 tái tổ hợp là môi trường BMMY, pH 6,0 với nồng độ cảm ứng methanol là 0,5%.
3. P53 tái tổ hợp được xác định chính xác bằng phương pháp điện di khơng biến tính trên gel polyacrylamide 10%. Phản ứng bám đặc hiệu của p53 tái tổ hợp và trình tự bám tương ứng trên promoter của gen mdm2 tạo thành phức hợp
protein/DNA dẫn đến phức hợp bị kéo chậm hơn các băng DNA tự do khi chạy trong điện trường.
4. Quá trình tinh sạch protein p53 tái tổ hợp được thực hiện bằng phương pháp sắc kí ái lực sử dụng cợt Niken-Sepharose. Nồng đợ protein p53 tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch là 0,0647mg/ml với hiệu suất thu hồi đạt 56%.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học và ảnh hưởng của protein p53 tái tổ hợp đối với sự phát triển các tế bào bình thường và các tế bào ung thư trong điều kiện in vitro.
Thử nghiệm và đánh giá sự ảnh hưởng của protein p53 tái tổ hợp trên mô hình đợng vật trong phịng thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Anh
1. Abdelmoula-Souissi S., Mabrouk I., Gargouri A. and Mokdad-Gargouri R. (2011), “Expression of the human tumor suppressor p53 induces cell death in Pichia pastoris”, FEMS Yeast Res, 12(1), pp. 2-8.
2. Abdelmoula-Souissi S., Zouari N., Miladi-Abdenadher I., Yaich-Kolsi O., Ayadi- Masmoudi I., Khabir A., Masmoudi H., Frikha M. and Mokdad-Gargouri R. (2012), “Secreted recombinant P53 protein from Pichia pastoris is a useful antigen for detection of serum p53: autoantibody in patients with advanced colorectal adenocarcinoma”, Mol Biol Rep, 40(5), pp. 3865-72.
3. Almazov V. P., Kochetkov D. V. and Chumakov P. M. (2009), “Use of p53 for Therapy of Human Cancer”, Molekuliarnaia Biologiia (Mosk), pp. 5-6.
4. Andreas C. J., Fersht A. R. (2010), “The Tumor Suppressor p53: From Structures to Drug Discovery”, Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(6), pp. 1-3.
5. Aramayo R., Sherman M. B., Brownless K., Lurz R., Okorokov A. L. and Orlova E. V. (2011), “Quaternary structure of the specific p53-DNA complex reveals the mechanism of p53 mutant dominance”, Nucleic Acids Res., 39(20), pp. 8960-71.
6. Arie Z., Deborah F., Ygal H., Yaacov B. and Moshe O. (1995), “A functional p53 responsive intronic promoter is contained within the human mdm2 gene”, Nucleic Acids Research, 23(14), pp. 2584-2592.
7. Arie Z., Yaacov B., Naomi R., Naomi L. and Moshe O. (1993), “Sequence-specific DNA binding by p53: identification of target sites and lack of binding to p53/MDM2 complexes”, The EMBO Journal, 12(7), pp. 2799-2808.
8. Balamurugan V., Reddy G. R. and Suryanarayana V. V. S. (2007), “Pichia
pastoris: A notable heterologous expression system for the production of foreign
9. Bei W., Ziwei X. and Ee-Chee R. (2009), “Redefining the p53 response element”,
PNAS, 106(34), pp. 14373–14378.
10. Bei W., Ziwei X., Hui L. K. and Ee-Chee R. (2010), “The p53 response element and transcriptional repression”, Cell Cycle, 9(5), pp. 870-879.
11. Bell S., Klein C., Mulle L., Hansen S. and Buchner J. (2002), “p53 contains large unstructured regions in its native state”, J Mol Biol, 322, pp. 917-927.
12. Bretthauer R. K., Castellino F. J. (1999), “Glycosylation of Pichia pastoris derived proteins”, Biotechnol. Appl. Biochem., 30, pp. 193-200.
13. Cereghino G. P., Cereghino J. L., Ilgen C. and Cregg J. M. (2002), “Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris”, Curr. Opin. Biotechnol., 13, pp. 329-332.
14. Cereghino J. L., Cregg J. M. (2000), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol. Rev., 24, pp. 45-66. 15. Collot-Teixeira S., Bass J., Denis F. and Ranger-Rogez S. (2004), “Human tumor
suppressor p53 and DNA viruses”, Rev. Med. Virol., 14, pp. 301-319.
16. David P. L., Chit F. C. and Sonia L. (2010), “p53-based Cancer Therapy”, Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(9), pp. a001222.
17. Dimitriadi M., Poulogiannis G., Liu L., Backlund L. M., Pearson D. M., Ichimura K. and Collins V. P. (2008), “p53-independent mechanisms regulate the P2-MDM2 promoter in adult astrocytic tumours”, British Journal of Cancer, 99, pp. 1144 -1152. 18. Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M., Dikshit R., Eser S., Rebelo M., Parkin D. M., Forman D., Bray F. and Mathers C. (2013), “Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer”, 11.
19. Fred Burz (2008), Principles of cancer genetics, Springer.
20. GBD 2015 Risk Factors Collaborators (2016), “Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational,
and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015”, Lancet, 388 (10053), pp. 1659-1724. 21. Ge T., Sun Z. J., Fu S. H. and Liang G. D. (2005), “Cloning of thrombolytic enzyme
(lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 42, pp. 20–28.
22. Geoffrey M. C. (2013), The Cell A Molecular Approach 6th Edition, Boston University.
23. Goh A. M., Coffill C. R. and Lane D. P. (2011), “The role of mutant p53 in human cancer”, J. Pathol., 223(2), pp. 116-26.
24. Hainaut P. (2013), “TP53 somatic mutations: prognostic and predictive value in human cancers. p53 in the Clinics”, Springer.
25. Haowei Y., Liu N., Zhao Z., Zhang X., Hao X., Shao B. and Yan W. (2012), “Expression and purification of human TAT-p53 fusion protein in Pichia pastoris
and its influence on HepG2 cell apoptosis”, Biotechnol. Lett., 34(7), pp. 1217-1233. 26. IARC (2012), “Section of Cancer Surveillance”, Globacan.
27. IARC (2017), “World cancer report 2014”.
28. Ilyas M., Straub J., Tomlinson I. P. M. and Bodmer W. F. (1999), “Gentic pathways in colorectal and other cancers”, European Journal of Cancer, pp. 335–351. 29. Isobe M., Emanuel B. S., Givol D., Oren M. and Croce C. M. (1986), “Localization
of gene for human p53 tumour antigen to band 17p13”, Nature, 320(6057), pp. 84-85. 30. Itai B., Karin R., Michael L., Lihi S. and Tali E. H. (2010), “Sequence-dependent