CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.8. Nghiên cứu các điều kiện nhằm biểu hiện p53 tái tổ hợp tốt nhất
2.2.8.1. Khảo sát chủng biểu hiện p53 tái tổ hợp
Để lựa chọn chủng P. pastoris X33 tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein p53 tốt nhất, năm chủng biến nạp có kết quả dương tính được lựa chọn ngẫu nhiên và nuôi lắc trong 5ml mơi trường YP có bổ sung 1% (w/v) glycerol với tốc đợ 250-300 vịng/phút ở 30oC qua đêm, sau đó 1% dịch ni qua đêm được chuyển sang 20ml mơi trường YPM mới. Sau mỗi 24 giờ, bình ni được đo OD600 và 0,5% (v/v) methanol được bổ sung để cảm ứng biểu hiện protein p53 tái tổ hợp. Dịch nuôi sau 72 giờ được thu lại, loại bỏ tế bào bằng cách ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút. Sau đó, protein trong dịch ni được tủa lại bằng acetone 100%, biến tính và điện di trên gel polyacrylamide 12% (Mục 2.2.9). Chủng tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protein tốt nhất được chúng tôi dùng để khảo sát các điều kiện biểu hiện khác nhằm thu được lượng sản phẩm tối ưu [1, 2, 25].
2.2.8.2. Khảo sát môi trường biểu hiện p53 tái tổ hợp
Để lựa chọn mơi trường thích hợp cho biểu hiện protein p53 ngoại bào, một chủng
P. pastoris X33 tái tổ hợp được nuôi biểu hiện trong năm môi trường khác nhau bao
gồm: BMMY, BMM, MMY, YPM, YPDM. Thành phần của các môi trường được thể hiện như trong bảng 2.2. Sau mỗi 24 giờ, các mẫu dịch nuôi biểu hiện được thu lại để xác định mật độ tế bào ở OD600 nm và bổ sung 0,5% methanol. Sau 72 giờ nuôi cấy, dịch ngoại bào được thu lại và protein ngoại bào được tủa bằng aceton 100%, biến tính và điện di trên gel polyacrylamide 12% (Mục 2.2.9). Môi trường biểu hiện tốt nhất protein p53 tái tổ hợp sẽ được sử dụng để khảo sát nồng độ methanol cảm ứng [1, 2].
2.2.8.3. Khảo sát nồng độ methanol cảm ứng biểu hiện p53 tái tổ hợp
Để xác định nồng đợ methanol có ảnh hưởng như thế nào đến sự cảm ứng biểu hiện protein p53 tái tổ hợp, chủng biến nạp tối ưu được nuôi cấy trong môi trường BMMY, pH 6,0 ở 30oC trong 72 giờ. Các bình ni khảo sát được bổ sung methanol với
các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0% sau mỗi 24 giờ nuôi cấy. Dịch nuôi biểu hiện được thu để xác định mật độ tế bào và khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp [1, 2, 42].