CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.10. Phương pháp EMSA
Phương pháp EMSA còn được gọi là điện di khơng biến tính, là mợt phương pháp nhanh và chính xác để phát hiện ra protein liên kết DNA tại các trình tự nhận biết cụ thể. Việc khảo sát này có thể được sử dụng để xác định cả về định tính và định lượng nếu mợt nhân tố phiên mã đặc biệt có trong nhân của các tế bào hoặc mô tế bào hoặc để xác định mợt protein chưa biết liên kết DNA có thể kiểm sốt sự biểu hiện gen quan tâm. Phép khảo nghiệm dựa trên khả năng của một yếu tố phiên mã liên kết mợt cách đặc biệt với mợt đầu dị oligonucleotide có đánh dấu (phóng xạ, huỳnh quang) và làm chậm quá trình di chuyển của nó trên gel polyacrylamide. Hình ảnh tín hiệu đánh dấu sẽ cho phép quan sát được sự di chuyển chậm của phức hợp sau quá trình điện di [6, 32,51].
Trong nghiên cứu này, chúng tơi thực hiện thí nghiệm này như sau: mợt đoạn trình tự nằm trên promoter mdm2 dài 187 bp có chứa hai trình tự bám của protein p53 (p53RE) và mợt đoạn trình tự thứ hai trên promoter mdm2 dài 200 bp khơng chứa trình tự bám của p53 (DCmdm2) đều được chúng tôi nhân bản bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu tương ứng MDM2-pro-Fw/MDM2-pro-Rv và DCmdm2-Fw/DCmdm2-Rv (Bảng 2.1). Phản ứng PCR được thực hiện với thành phần tương tự như đã trình bày trong bảng 2.5 và chu trình nhiệt được cài đặt như sau: 94oC - 5 phút, 35 chu kỳ (94oC - 40 giây, 60oC - 30 giây, 72oC - 30 giây), kéo dài 5 phút ở 72oC.
Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 2% (Mục 2.2.3) để kiểm tra, sau đó được tiến hành tinh sạch theo quy trình ở mục 2.2.4. Sản phẩm tinh sạch được sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng EMSA với phản ứng liên kết protein/DNA được tiến hành có thành phần như đã trình bày trong bảng 2.8. Thời gian ủ phản ứng là 1 giờ, trong điều kiện nhiệt đợ phịng. Song song cùng bước thí nghiệm trên, mợt bản gel 10%
bể điện di với đệm TBE 0,5X, chạy trước trong điều kiện khơng có mẫu ở nhiệt đợ 4oC trong 60 phút, điện áp 200V. Sau đó, 20µl của phản ứng được chuyển lên bản gel điện di. Quá trình điện di được thực hiện ở 4oC trong 1 giờ 30 phút, điện áp 150V. Bản gel sau đó được tách ra, nhuộm EtBt và soi dưới đèn UV để quan sát kết quả.
Bảng 2.7. Thành phần gel polyacrylamide cho thí nghiệm EMSA
Thành phần Thể tích (µl) Nước cất 2614 30% acrylamide 1667 TBE 5X 500 Glycerol 125 10% APS 50 TEMED 13 Tổng 5000 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng EMSA
Thành phần DNA tự do (µl) Protein + DNA(µl)
H2O 11 1
5X EMSA buffer 4 4
DNA 5 5
Protein - 10