Chú thích: giếng M: marker 1 kb, giếng X33, X33*: sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của chủng
X33 không biến nạp và chủng biến nạp X33/pPICZαA, giếng 17-36: sản phẩm PCR với khuôn là DNA tổng số của các chủng biến nạp X33/pPICZαA-TAT-p53-His tương ứng, giếng ĐC: đối chứng âm.
Từ kết quả điện di quan sát được trên gel agarose, chúng tôi nhận thấy: đối với cặp mồi đặc hiệu cho gen (EcoRI-Fw/XhoI-Rv), các giếng đều xuất hiện mợt băng với kích thước khoảng 1.200 bp, tương ứng với kích thước gen TAT-p53-His đã thiết kế (Giếng 17- 36, Hình 3.5). Đối với cặp mồi AOX1, sản phẩm PCR đều cho kết quả là hai băng DNA bao gồm: mợt băng DNA với kích thước khoảng 2.200 bp tương ứng kích thước vùng AOX1 vốn có trên hệ gen của nấm men (Giếng X33-36, Hình 3.6); mợt băng DNA có kích thước khoảng 1.800 bp bao gồm kích thước gen TAT-p53-His (1.247 bp) và đoạn DNA dài khoảng 600 bp nằm giữa hai trình tự mồi xuôi (5’-AOX1) và mồi ngược (3’- AOX1) trên vector pPICZαA (Giếng 17-36, Hình 3.6). Kết quả này đúng với tính tốn lý thuyết. Như vậy, có thể kết luận đoạn pPICZαA-TAT-p53-His đã được chèn thành công vào hệ gen của của nấm men P. pastoris chủng X33. Kết hợp hai hình ảnh điện di, chúng tôi nhận thấy các chủng X33-17, X33-20, X33-27, X33-34, X33-36 có đợ sáng của băng 1,2 kb và 1,8 kb đậm hơn hai chủng X33-24, X33-26. Từ đó có thể phán đốn đoạn DNA ngoại lai được chèn vào các chủng X33-17, X33-20, X33-27, X33-34, X33-36 có khả năng
nhiều bản copy hơn hai chủng còn lại, đồng nghĩa với khả năng biểu hiện lượng protein p53 tái tổ hợp cao hơn. Từ kết quả này, năm chủng trên đã được chọn để sử dụng tiếp cho thí nghiệm chọn lọc chủng X33 có khả năng biểu hiện p53 tái tổ hợp tốt nhất.
3.2. Tối ưu quy trình bi ểu hiện p53 tái tổ hợp ở nấm men P. pastoris X33
3.2.1. Lựa chọn dòng biểu hiện p53 tái tổ hợp
Để kiểm tra chính xác sự tổng hợp protein p53 tái tổ hợp, quan sát kích thước và mức độ biểu hiện của protein p53, chúng tôi chọn lựa năm chủng X33 (X33-17, X33-20, X33-27, X33-34 và X33-36) đã được kiểm tra có mang DNA tái tổ hợp để chọn ra mợt chủng có khả năng biểu hiện tốt nhất. Năm chủng này được nuôi biểu hiện trong môi trường YPM (Mục 2.2.8.1) và được đo OD600 nm sau mỗi 24 giờ nuôi cấy. Mẫu protein ngoại bào thu từ dịch nuôi cấy được tủa acetone với tỉ lệ 1:3, biến tính và chạy điện di trên gel polyacrylamide 12%. Sau điện di, bản gel được nhuộm CBB để quan sát kết quả.
Hình 3.7. Kết quả sinh trưởng của các dịng biểu hiện sau 72 giờ
Kết quả đo OD600 nm cho thấy đường sinh trưởng của các chủng biến nạp qua 72 giờ nuôi cấy không khác biệt nhiều so với chủng X33 đối chứng (Hình 3.7). Trong đó, đường sinh trưởng của hai chủng X33-27 và X33-36 có khả năng sinh trưởng cao hơn các chủng còn lại. Như vậy, sức sống của chủng X33 tái tổ hợp ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của protein ngoại lai.
Hình 3.8. Kết quả điện di protein tổng số từ các dịng biến nạp
Chú thích: Giếng X33*: chủng X33 biến nạp pPICZαA (đối chứng); giếng 17-36: các chủng
X33 tương ứng từ 17-36 chứa vector tái tổ hợp pPICZαA-TAT-p53-His.
Kết quả điện di ở hình 3.8 cho thấy ở tất cả các chủng khảo nghiệm thì đều có xuất hiện xuất hiện mợt băng kích thước khoảng 47 kDa (Giếng 17-36, Hình 3.8), tương đương với kích thước của protein p53 tái tổ hợp đã thiết kế (bao gồm 43,7 kDa là kích thước thật của p53, và 3,3 kDa của đầu TAT và đuôi 6X Histidine), đồng thời băng này không xuất hiện ở chủng P. pastoris X33/pPICZαA (Giếng X33*, Hình 3.8). Ngồi ra, ở chủng X33-36 có xuất hiện thêm mợt băng protein khá đậm có kích thước khoảng 57 kDa. Tham khảo các báo cáo biểu hiện p53 từ các nhóm nghiên cứu trước đây, đặc biệt là kết quả của nhóm Salma Abdelmoula-Souissi (2012) [2], chúng tôi nhận định đây
cũng là băng protein p53 tái tổ hợp có chứa thêm đầu α-peptide (gồm 10 amino acid) chưa được cắt bỏ (có khối lượng khoảng 10 kDa). Như vậy, chúng tơi kết luận đã có thể biểu hiện được protein p53 tái tổ hợp trong P. pastoris X33 và lựa chọn chủng X33-36 là chủng biểu hiện chính, sử dụng cho các thí nghiệm khảo sát điều kiện tối ưu khác.
3.2.2. Tối ưu môi trường biểu hiện p53 tái tổ hợp
Để khảo sát mức độ biểu hiện protein p53 tái tổ hợp trên các môi trường khác nhau, chúng tôi chọn chủng P. pastoris X33-36 tái tổ hợp đã được kiểm tra có chứa gen
TAT-p53-His và có sức sinh trưởng tốt để nuôi biểu hiện trong năm môi trường khác
nhau là BMMY, YPM, YPDM, BMM và MMY (Mục 2.2.8.2). Q trình ni biểu hiện trên năm môi trường này đều được cảm ứng bằng 0,5% methanol sau mỗi 24 giờ nuôi cấy và đo OD600 nm. Sau 72 giờ cảm ứng, dịch nổi được thu nhờ ly tâm 3.000 vòng/phút trong 10 phút, tủa bằng aceton 100% với tỉ lệ 1:3, sau đó tủa được hịa tan bằng nước và điện di biến tính trên gel polyacrylamide 12% để đánh giá kết quả.
Từ kết quả OD600 của chủng tái tổ hợp X33-36 trong năm môi trường khác nhau, chúng tôi nhận thấy thể biến nạp được nuôi trong môi trường BMMY có sức sống tốt hơn các môi trường khác, sức sinh trưởng không suy giảm nhiều so với chủng đối chứng.
Hình 3.10. Kết quả điện di protein tổng số từ các mơi trường biểu hiện
Chú thích: Giếng M: marker, giếng ĐC: chủng X33/pPICZαA nuôi trong môi trường BMMY,
giếng YPM, YPDM, MMY, BMM, BMMY: chủng X33/pPICZαA-TAT-p53-His biểu hiện ở các môi trường tương ứng.
Kết quả điện di ở hình 3.10 cho thấy, ở các môi trường YPM, YPDM, MMY, BMM và BMMY đều xuất hiện một băng protein kích thước khoảng 47 kDa đúng bằng với kích thước lý thuyết của protein p53 tái tổ hợp đã thiết kế. Chủng X33-36 trong thí nghiệm này ở môi trường YPM lại không xuất hiện băng 57 kDa như kết quả ở mục 3.3.2, như vậy rõ ràng các đầu α-peptide đã được loại bỏ và kết luận trước đó của chúng tơi là phù hợp. Protein biểu hiện mạnh và cho băng điện di đậm nhất ở môi trường BMMY. Như vậy, môi trường BMMY đã được chúng tôi lựa chọn sử dụng cho các nghiên cứu tối ưu điều kiện biểu hiện protein tiếp theo. Kết quả này phù hợp với một số kết quả biểu hiện p53 tái tổ hợp đã cơng bố của nhóm tác giả nhóm Haowei Yan (2012) [25] và Salma Abdelmoula-Souissi (2013) [2].
3.2.3. Tối ưu nồng độ methanol cảm ứng biểu hiện
Trong quá trình biểu hiện, methanol được bổ sung sau mỗi 24 giờ ni cấy với vai trị là chất cảm ứng promoter AOX1 kiểm sốt q trình sinh tổng hợp protein tái tổ hợp. Mức độ biểu hiện p53 khác nhau khi được cảm ứng methanol ở các nồng độ khác nhau. Khảo sát dải nồng độ methanol cảm ứng từ 0,5-2,0%, chúng tôi nhận thấy, khả năng sinh trưởng của chủng tái tổ hợp X33-36 suy giảm dần khi được nuôi cảm ứng với nồng đợ methanol tăng dần (Hình 3.11).
Hình 3.11. Kết quả sinh trưởng của chủng X33-36 ở các nồng độ methanol
Chú thích: chủng X33* được ni ở mơi trường BMMY, nồng độ cảm ứng methanol 0,5%;.
chủng X33-36 được nuôi ở môi trường BMMY , nồng độ cảm ứng methanol từ 0,5-2%.
Kết quả điện di trên gel polyacrylamide cho thấy, mức độ biểu hiện protein p53 tái tổ hợp có xu hướng giảm dần khi nồng độ methanol tăng lên, tương ứng với mức độ nhạt của băng protein quan sát được (Hình 3.12). Khả năng biểu hiện p53 tái tổ hợp của chủng X33-36 đạt cực đại ở nồng độ cảm ứng methanol là 0,5% (Giếng 0,5%, Hình 3.12). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu của các nhóm Haowei Yan (2012) [25],
Salma Abdelmoula-Souissi (2011, 2012) [1, 2] đã công bố trước đây về việc biểu hiện p53 tái tổ hợp ở nấm men P. pastoris.
Hình 3.12. Kết quả điện di protein từ dịch nuôi cảm ứng với các nồng độ methanol
Chú thích: Giếng M: marker, giếng 0,5% - 2,0%: chủng X33/pPICZαA-TAT-p53-His biểu hiện
p53 ở những nồng độ methanol tương tứng từ 0,5%-2,0%.
3.3. Tinh sạch và định lượng protein p53 tái tổ hợp thu được
3.3.1. Tinh sạch protein p53 tái tổ hợp
Sau khi đã lựa chọn được chủng nấm men tái tổ hợp và tối ưu điều kiện biểu hiện p53 tái tổ hợp, chúng tôi đã tiến hành sản xuất với thể tích ni cấy lớn hơn là 200 ml môi trường BMMY, nồng độ cảm ứng methanol là 0,5%. Sau 72h ni cấy, tồn bợ dịch nuôi cấy được thu lại, sử dụng cột cô mẫu Pierce™ Protein Concentrator PES 30K MWCO (Thermo) để loại bỏ những protein tạp còn lại trong dịch nuôi cấy. Cột cô mẫu cho phép loại bỏ các protein có khối lượng nhỏ hơn 30 kDa trơi xuống, trong khi protein p53 tái tổ hợp có khối lượng là 47 kDa, do đó chúng tơi có thể cơ đọng mẫu lại cịn 40ml dịch. Như vậy nồng độ protein trong dịch nuôi cấy đã được cô lại 5 lần. Mẫu cơ sau đó được hịa lại với đệm gắn cợt với tỉ lệ 1:2 để tạo điều kiện cho protein p53 bám tốt lên
cột tinh sạch. Độ sạch của TAT-p53-His được kiểm tra trên gel polyacrylamide 12%, nhuộm CBB và quan sát bằng mắt thường.
Hình 3.13. Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch p53 tái tổ hợp từ dịch ngoại bào
Chú thích: Giếng M: marker, giếng DC: dịch lên cột, giếng FT: dịch trôi qua cột, giếng W: dịch
rửa cột, giếng E5-8: các phân đoạn thu được khi đẩy protein ra khỏi cột.
Kết quả điện di SDS-PAGE (Hình 3.13) cho thấy phân đoạn protein gắn trên cột Niken-Sepharose được rửa chiết ra bằng đệm có chứa imidazol 200 mM có băng 47 kDa của protein p53 tái tổ hợp. Tuy vậy, hiệu suất gắn cợt chưa cao (có băng 47 kDa của p53 tái tổ hợp trong phân đoạn FT qua cột Niken-Sepharose) dẫn đến hiệu suất thu hồi p53 còn bị hao hụt. Để đánh giá mức độ thu hồi protein, chúng tôi tiếp tục tiến hành định lượng protein đã thu được bằng phương pháp Bradford. Kết quả Bradford sẽ giúp chúng tôi thẩm định khả năng biểu hiện protein p53 tái tổ hợp và có thể so sánh hiệu suất với các nhóm nghiên cứu trước đây.
3.3.2. Định lượng protein p53 bằng phương pháp Bradford
Để xác định hiệu suất tinh sạch qua cột Niken-Sapharose, hàm lượng protein trong các dịch mẫu theo các bước tinh sạch được xác định theo phương pháp Bradford (Mục
phút ủ ở nhiệt đợ phịng được chúng tôi sử dụng để xây dựng đường chuẩn Bradford. Chỉ số tin cậy R2 đạt 0,9893 cho thấy đường chuẩn xây dựng được đạt độ tin cậy cao.
Bảng 3.2. Kết quả đo OD595 nm dựng đường chuẩn
mBSA (µg) 0 5 10 20 30 40 50
OD595 nm 0 0.33 0.455 0.617 0.825 0.944 1.077
Đường chuẩn Bradford xây dựng được có phương trình là y = 0.0165x + 0.2806.
Hình 3.14. Đường chuẩn Bradford
Dựa vào phương trình đường chuẩn (Hình 3.14), chúng tôi xác định được nồng độ trong mẫu cần định lượng (X) bằng công thức sau:
X (mg/ml) = (𝑦−0,2806) 0,0165.𝑉
Trong đó, y là giá trị OD595 nm đã đo được ở mẫu, V (µl) là thể tích mẫu đã sử dụng trong phản ứng Bradford. y = 0.0165x + 0.2806 R² = 0.9893 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 10 20 30 40 50 60 OD 595 mBSA(µg)
Với 3 ml dịch cơ được đưa lên cột, chúng tôi thu lại được 3 ml dịch tinh sạch chứa protein p53 tái tổ hợp và sử dụng để làm mẫu đo trong phản ứng định lượng Bradford. Kết quả đo OD600 nm và nồng độ protein tương ứng được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả Bradford của quá trình tinh sạch
Dịch cơ Dịch trơi cột FT TAT-p53-His Hiệu suất (%)
V (µl) 50 150 50 -
OD595 nm 0,758 0,763 0,545 -
Nồng độ (mg/ml) 0,578 0,195 0,321 56
Lượng protein tổng số trong 3ml dịch cô là:
mprotein t ổng số = 0,587 x 3 = 1,734 (mg)
Lượng protein p53 tái tổ hợp thu được trong 3ml dịch tinh sạch là: mp53 = 0,321 x 3 = 0,963 (mg)
Hiệu suất tinh sạch là:
H = mp53 : mprotein t ổng số = 0,963 : 1,734 = 0,56 Với 40ml dịch cô, lượng protein tổng số là:
mprotein tổng số = 40 x 0,578 = 23,12 (mg)
Với hiệu suất H= 0,56, tổng lượng p53 tái tổ hợp thu được từ 40ml dịch cô là: mp53 = 23,12 x 0,56 = 12,95 (mg)
Do vậy, với 200ml môi trường nuôi biểu hiện (tương đương với 40ml dịch cơ) thì nồng đợ p53 tái tổ hợp thu hồi được là 12,95 mg, tương đương với nồng độ của protein
Haowei Yan (2012) [25], chúng tôi nhận thấy khả năng biểu hiện protein p53 tái tổ hợp sau khi cải biến tốt hơn so với nhóm nghiên cứu trước (nhóm Haowei Yan thu được khoảng 104 mg TAT-p53 trong 2L môi trường nuôi cấy, tương đương với nồng độ 0,052mg/ml). Và đồng thời, điều này cũng cho thấy mức độ biểu hiện prorein hòa tan tương đối cao hơn so với mức độ biểu hiện ở sinh vật bậc thấp hơn (khoảng 0,008mg/ml) đã được báo cáo trước đây trong hệ thống biểu hiện prokaryote (Jiang và cộng sự, 2008).
3.4. Xác định protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA
Chúng tôi đã tiến hành nhân bản hai đoạn DNA nằm trên promoter của gen mdm2
bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Mục 2.2.10) trong đó đoạn DNA thứ nhất (p53RE) có kích thước là 187 bp có mang trình tự gắn đặc hiệu của p53 (Phụ lục) và đoạn DNA thứ hai (DCmdm2) có kích thước 200 bp khơng mang trình tự gắn đặc hiệu của p53. Chúng tôi tạo phản ứng bám cho protein p53 tái tổ hợp với trình tự bám đặc hiệu trên promoter của gen mdm2 trong điều kiện in vitro. Theo nguyên tắc, khi phức
hợp protein/DNA được tạo thành, DNA sẽ có trọng lượng nặng hơn. Do đó, khi chạy trong điện trường, các băng DNA có gắn protein sẽ đi chậm hơn so với các băng DNA tự do và không cịn giữ chuẩn kích thước khi so sánh với thang chuẩn marker. Từ kết quả điện di thể hiện trong hình 3.15, chúng tơi nhận thấy phức hợp p53/p53RE đã được tạo thành, do băng ở giếng 2 (Hình 3.15) đã đi chậm hơn so với giếng đối chứng có chứa đoạn DNA p53RE dạng tự do (Giếng 1, Hình 3.15). Do khơng có phản ứng bám giữa
Taq và p53RE nên băng DNA ở giếng 3 (Hình 3.15) vẫn giữa chuẩn kích thước bằng với băng DNA ở giếng đối chứng (Giếng 1, Hình 3.15). Để chứng minh sự bám giữa p53 tái tổ hợp và DNA mục tiêu là đặc hiệu, chúng tôi thực hiện thêm phản ứng tương tác giữa p53 tái tổ hợp với đoạn DCmdm2 (đối chứng mdm2) cũng nằm trên promoter của mdm2 nhưng khơng chứa trình tự bám của p53. Kết quả ở giếng 4 và 5 (Hình 3.15) cho hai băng DNA bằng nhau và có kích thước 200 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của
protein dạng tự nhiên. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của nhóm Arie Zauberman và cợng sự thực hiện năm 1995 [6] với p53 dạng tự nhiên và dạng đột biến. Với những kết quả đã đạt được có thể kết luận protein p53 tái tổ hợp do chúng tôi tổng hợp cũng có hoạt tính sinh học, có thể gắn với DNA như một nhân tố phiên mã – một chức năng quan trọng thiết yếu để ứng dụng p53 tái tổ hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.15. Kết quả điện di khơng biến tính protein p53 tái tổ hợp
Chú thích: Giếng M: marker DNA 100 bp, giếng 1: RE, giếng 2: p53 + p53RE, giếng 3:
KẾT LUẬN
1. Đã tách chiết thành công vector biểu hiện pPICZαA/TAT-p53-His với khối lượng lớn từ chủng vi khuẩn E. coli DH5α với độ tinh sạch cao đạt yêu cầu cho phản ứng biến nạp vào chủng nấm men P. pastoris X33. Cấu trúc biểu hiện
pPICZαA/TAT-p53-His dung hợp vào trong DNA hệ gen của P. pastoris X33
đã được kiểm tra bằng kĩ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.