CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.12. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford
Nguyên tắc của phương pháp Bradford là khi protein phản ứng với CBB sẽ tạo phức hợp màu có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở bước sóng 595 nm. Cường đợ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lượng protein tổng số được xác định dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò BSA [57].
Thí nghiệm được tiến hành như sau: pha loãng BSA 100X (nồng độ 10mg/ml) xuống cịn nồng đợ 1,0mg/ml. Chuẩn bị các ống effendorf 1,5ml có bọc giấy bạc (do CBB nhạy cảm với ánh sáng) và đánh số từ 1 đến 7 và một số ống khác chứa mẫu protein cần định lượng. Mỗi ống effendorf được pha với dung dịch Bradford và đệm theo thành phần như trình bày trong bảng 2.9 để thu được nồng độ BSA từ 0µg/ml đến 50µg/ml. Khi ống thứ nhất ủ được 5 phút thì tiếp tục pha ống thứ hai và cứ như thế cho đến hết.
thì bắt đầu tiến hành đo OD595 nm, tiếp tục lặp lại với mẫu thứ hai khi đạt được 40 phút cho đến khi hết mẫu. Kết quả đo OD595 nm được ghi nhận và sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Chỉ số tin cậy R2 càng gần 1 thì kết quả xây dựng đường chuẩn càng đáng tin cậy.
Bảng 2.9. Thành phần của phản ứng Bradford Ống số 1 2 3 4 5 6 7 Ống số 1 2 3 4 5 6 7 mBSA (µg) 0 5 10 20 30 40 50 VBSA (µl) 0 5 10 20 30 40 50 Elution buffer 400 395 390 380 370 360 350 Bradford buffer 600 600 600 600 600 600 600 Tổng (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
Đường chuẩn có phương trình y = ax + b. Trong đó, y là đợ hấp phụ ở bước sóng 595 nm (OD595) và x là hàm lượng protein (mg). Dựa vào đường chuẩn có thể tính được tương đối lượng protein thu được trong mẫu cần định lượng.