Dịch cô Dịch trôi cột FT TAT-p53-His Hiệu suất (%)
V (µl) 50 150 50 -
OD595 nm 0,758 0,763 0,545 -
Nồng độ (mg/ml) 0,578 0,195 0,321 56
Lượng protein tổng số trong 3ml dịch cô là:
mprotein t ổng số = 0,587 x 3 = 1,734 (mg)
Lượng protein p53 tái tổ hợp thu được trong 3ml dịch tinh sạch là: mp53 = 0,321 x 3 = 0,963 (mg)
Hiệu suất tinh sạch là:
H = mp53 : mprotein t ổng số = 0,963 : 1,734 = 0,56 Với 40ml dịch cô, lượng protein tổng số là:
mprotein tổng số = 40 x 0,578 = 23,12 (mg)
Với hiệu suất H= 0,56, tổng lượng p53 tái tổ hợp thu được từ 40ml dịch cô là: mp53 = 23,12 x 0,56 = 12,95 (mg)
Do vậy, với 200ml môi trường nuôi biểu hiện (tương đương với 40ml dịch cơ) thì nồng đợ p53 tái tổ hợp thu hồi được là 12,95 mg, tương đương với nồng độ của protein
Haowei Yan (2012) [25], chúng tôi nhận thấy khả năng biểu hiện protein p53 tái tổ hợp sau khi cải biến tốt hơn so với nhóm nghiên cứu trước (nhóm Haowei Yan thu được khoảng 104 mg TAT-p53 trong 2L môi trường nuôi cấy, tương đương với nồng độ 0,052mg/ml). Và đồng thời, điều này cũng cho thấy mức độ biểu hiện prorein hòa tan tương đối cao hơn so với mức độ biểu hiện ở sinh vật bậc thấp hơn (khoảng 0,008mg/ml) đã được báo cáo trước đây trong hệ thống biểu hiện prokaryote (Jiang và cộng sự, 2008).
3.4. Xác định protein p53 tái tổ hợp bằng phương pháp EMSA
Chúng tôi đã tiến hành nhân bản hai đoạn DNA nằm trên promoter của gen mdm2
bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Mục 2.2.10) trong đó đoạn DNA thứ nhất (p53RE) có kích thước là 187 bp có mang trình tự gắn đặc hiệu của p53 (Phụ lục) và đoạn DNA thứ hai (DCmdm2) có kích thước 200 bp khơng mang trình tự gắn đặc hiệu của p53. Chúng tôi tạo phản ứng bám cho protein p53 tái tổ hợp với trình tự bám đặc hiệu trên promoter của gen mdm2 trong điều kiện in vitro. Theo nguyên tắc, khi phức
hợp protein/DNA được tạo thành, DNA sẽ có trọng lượng nặng hơn. Do đó, khi chạy trong điện trường, các băng DNA có gắn protein sẽ đi chậm hơn so với các băng DNA tự do và không cịn giữ chuẩn kích thước khi so sánh với thang chuẩn marker. Từ kết quả điện di thể hiện trong hình 3.15, chúng tơi nhận thấy phức hợp p53/p53RE đã được tạo thành, do băng ở giếng 2 (Hình 3.15) đã đi chậm hơn so với giếng đối chứng có chứa đoạn DNA p53RE dạng tự do (Giếng 1, Hình 3.15). Do khơng có phản ứng bám giữa
Taq và p53RE nên băng DNA ở giếng 3 (Hình 3.15) vẫn giữa chuẩn kích thước bằng với băng DNA ở giếng đối chứng (Giếng 1, Hình 3.15). Để chứng minh sự bám giữa p53 tái tổ hợp và DNA mục tiêu là đặc hiệu, chúng tôi thực hiện thêm phản ứng tương tác giữa p53 tái tổ hợp với đoạn DCmdm2 (đối chứng mdm2) cũng nằm trên promoter của mdm2 nhưng khơng chứa trình tự bám của p53. Kết quả ở giếng 4 và 5 (Hình 3.15) cho hai băng DNA bằng nhau và có kích thước 200 bp, tương ứng với kích thước lý thuyết của
protein dạng tự nhiên. Kết quả này tương tự như kết quả nghiên cứu của nhóm Arie Zauberman và cộng sự thực hiện năm 1995 [6] với p53 dạng tự nhiên và dạng đột biến. Với những kết quả đã đạt được có thể kết luận protein p53 tái tổ hợp do chúng tôi tổng hợp cũng có hoạt tính sinh học, có thể gắn với DNA như một nhân tố phiên mã – một chức năng quan trọng thiết yếu để ứng dụng p53 tái tổ hợp cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.15. Kết quả điện di khơng biến tính protein p53 tái tổ hợp
Chú thích: Giếng M: marker DNA 100 bp, giếng 1: RE, giếng 2: p53 + p53RE, giếng 3:
KẾT LUẬN
1. Đã tách chiết thành công vector biểu hiện pPICZαA/TAT-p53-His với khối lượng lớn từ chủng vi khuẩn E. coli DH5α với độ tinh sạch cao đạt yêu cầu cho phản ứng biến nạp vào chủng nấm men P. pastoris X33. Cấu trúc biểu hiện
pPICZαA/TAT-p53-His dung hợp vào trong DNA hệ gen của P. pastoris X33
đã được kiểm tra bằng kĩ thuật PCR với các cặp mồi đặc hiệu.
2. Đã lựa chọn chủng X33-36 là chủng biến nạp biểu hiện p53 tái tổ hợp. Môi trường tối ưu để biểu hiện protein p53 tái tổ hợp là môi trường BMMY, pH 6,0 với nồng độ cảm ứng methanol là 0,5%.
3. P53 tái tổ hợp được xác định chính xác bằng phương pháp điện di khơng biến tính trên gel polyacrylamide 10%. Phản ứng bám đặc hiệu của p53 tái tổ hợp và trình tự bám tương ứng trên promoter của gen mdm2 tạo thành phức hợp
protein/DNA dẫn đến phức hợp bị kéo chậm hơn các băng DNA tự do khi chạy trong điện trường.
4. Quá trình tinh sạch protein p53 tái tổ hợp được thực hiện bằng phương pháp sắc kí ái lực sử dụng cợt Niken-Sepharose. Nồng đợ protein p53 tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch là 0,0647mg/ml với hiệu suất thu hồi đạt 56%.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu xác định hoạt tính sinh học và ảnh hưởng của protein p53 tái tổ hợp đối với sự phát triển các tế bào bình thường và các tế bào ung thư trong điều kiện in vitro.
Thử nghiệm và đánh giá sự ảnh hưởng của protein p53 tái tổ hợp trên mơ hình đợng vật trong phịng thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Anh
1. Abdelmoula-Souissi S., Mabrouk I., Gargouri A. and Mokdad-Gargouri R. (2011), “Expression of the human tumor suppressor p53 induces cell death in Pichia pastoris”, FEMS Yeast Res, 12(1), pp. 2-8.
2. Abdelmoula-Souissi S., Zouari N., Miladi-Abdenadher I., Yaich-Kolsi O., Ayadi- Masmoudi I., Khabir A., Masmoudi H., Frikha M. and Mokdad-Gargouri R. (2012), “Secreted recombinant P53 protein from Pichia pastoris is a useful antigen for detection of serum p53: autoantibody in patients with advanced colorectal adenocarcinoma”, Mol Biol Rep, 40(5), pp. 3865-72.
3. Almazov V. P., Kochetkov D. V. and Chumakov P. M. (2009), “Use of p53 for Therapy of Human Cancer”, Molekuliarnaia Biologiia (Mosk), pp. 5-6.
4. Andreas C. J., Fersht A. R. (2010), “The Tumor Suppressor p53: From Structures to Drug Discovery”, Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(6), pp. 1-3.
5. Aramayo R., Sherman M. B., Brownless K., Lurz R., Okorokov A. L. and Orlova E. V. (2011), “Quaternary structure of the specific p53-DNA complex reveals the mechanism of p53 mutant dominance”, Nucleic Acids Res., 39(20), pp. 8960-71.
6. Arie Z., Deborah F., Ygal H., Yaacov B. and Moshe O. (1995), “A functional p53 responsive intronic promoter is contained within the human mdm2 gene”, Nucleic Acids Research, 23(14), pp. 2584-2592.
7. Arie Z., Yaacov B., Naomi R., Naomi L. and Moshe O. (1993), “Sequence-specific DNA binding by p53: identification of target sites and lack of binding to p53/MDM2 complexes”, The EMBO Journal, 12(7), pp. 2799-2808.
8. Balamurugan V., Reddy G. R. and Suryanarayana V. V. S. (2007), “Pichia
pastoris: A notable heterologous expression system for the production of foreign
9. Bei W., Ziwei X. and Ee-Chee R. (2009), “Redefining the p53 response element”,
PNAS, 106(34), pp. 14373–14378.
10. Bei W., Ziwei X., Hui L. K. and Ee-Chee R. (2010), “The p53 response element and transcriptional repression”, Cell Cycle, 9(5), pp. 870-879.
11. Bell S., Klein C., Mulle L., Hansen S. and Buchner J. (2002), “p53 contains large unstructured regions in its native state”, J Mol Biol, 322, pp. 917-927.
12. Bretthauer R. K., Castellino F. J. (1999), “Glycosylation of Pichia pastoris derived proteins”, Biotechnol. Appl. Biochem., 30, pp. 193-200.
13. Cereghino G. P., Cereghino J. L., Ilgen C. and Cregg J. M. (2002), “Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris”, Curr. Opin. Biotechnol., 13, pp. 329-332.
14. Cereghino J. L., Cregg J. M. (2000), “Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris”, FEMS Microbiol. Rev., 24, pp. 45-66. 15. Collot-Teixeira S., Bass J., Denis F. and Ranger-Rogez S. (2004), “Human tumor
suppressor p53 and DNA viruses”, Rev. Med. Virol., 14, pp. 301-319.
16. David P. L., Chit F. C. and Sonia L. (2010), “p53-based Cancer Therapy”, Cold Spring Harb Perspect Biol, 2(9), pp. a001222.
17. Dimitriadi M., Poulogiannis G., Liu L., Backlund L. M., Pearson D. M., Ichimura K. and Collins V. P. (2008), “p53-independent mechanisms regulate the P2-MDM2 promoter in adult astrocytic tumours”, British Journal of Cancer, 99, pp. 1144 -1152. 18. Ferlay J., Soerjomataram I., Ervik M., Dikshit R., Eser S., Rebelo M., Parkin D. M., Forman D., Bray F. and Mathers C. (2013), “Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC Cancer”, 11.
19. Fred Burz (2008), Principles of cancer genetics, Springer.
20. GBD 2015 Risk Factors Collaborators (2016), “Global, regional, and national comparative risk assessment of 79 behavioural, environmental and occupational,
and metabolic risks or clusters of risks, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015”, Lancet, 388 (10053), pp. 1659-1724. 21. Ge T., Sun Z. J., Fu S. H. and Liang G. D. (2005), “Cloning of thrombolytic enzyme
(lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 42, pp. 20–28.
22. Geoffrey M. C. (2013), The Cell A Molecular Approach 6th Edition, Boston University.
23. Goh A. M., Coffill C. R. and Lane D. P. (2011), “The role of mutant p53 in human cancer”, J. Pathol., 223(2), pp. 116-26.
24. Hainaut P. (2013), “TP53 somatic mutations: prognostic and predictive value in human cancers. p53 in the Clinics”, Springer.
25. Haowei Y., Liu N., Zhao Z., Zhang X., Hao X., Shao B. and Yan W. (2012), “Expression and purification of human TAT-p53 fusion protein in Pichia pastoris
and its influence on HepG2 cell apoptosis”, Biotechnol. Lett., 34(7), pp. 1217-1233. 26. IARC (2012), “Section of Cancer Surveillance”, Globacan.
27. IARC (2017), “World cancer report 2014”.
28. Ilyas M., Straub J., Tomlinson I. P. M. and Bodmer W. F. (1999), “Gentic pathways in colorectal and other cancers”, European Journal of Cancer, pp. 335–351. 29. Isobe M., Emanuel B. S., Givol D., Oren M. and Croce C. M. (1986), “Localization
of gene for human p53 tumour antigen to band 17p13”, Nature, 320(6057), pp. 84-85. 30. Itai B., Karin R., Michael L., Lihi S. and Tali E. H. (2010), “Sequence-dependent cooperative binding of p53 to DNA targets and its relationship to the structural properties of the DNA targets”, Nucleic Acids Research, 39(5), pp. 1919–1932.
31. Jiang L., Ma Y., Wang J., Tao X. and Wei D., (2008), “The transduction of His- TAT-p53 fusion protein into the human osteogenic sarcoma cell line (Saos -2) and its influence on cell cycle arrest and apoptosis”, Mol. Biol. Rep., 35(1), pp. 1-8.
32. Jie L., Wei X., Xueting S., Xingliang Q., Ying C., Shaohua L., Jie D., Hongmei D., Hui L., Aixue H., Xingfeng G., Lvbin H., Chaonan W., Leqiao S., Chenjun B., Xuelian S., Tao F., Yuanlin L., Yi Z., Hongru Z., Hongwen Z. and Ningsheng S. (2015), “Species-specifc mutual regulation of p53 and miR-138 between human, rat and mouse”, Scientific reports, 6(26187).
33. Joana D. A., Joana M. X., Clifford J. S. and Cecilia M. R. (2010), “The Role of p53 in Apoptosis”, Discov Med, 9(45), pp. 145-152.
34. Le Tran Ngoan (2007), “Cancer Mortality Pattern in Viet Nam”, Asian Pac J Cancer Prev, 8, pp. 535-538.
35. Leader B., Baca Q. J. and Golan D. E. (2008), “Protein therapeutics: a summary and pharmacological classification”, Nat. Rev. Drug. Discov., 7(1), pp. 21-39.
36. Levine A. J. and Oren M. (2009), “The first 30 years of p53: growing ever more complex”, Nature Reviews Cancer, 9, pp. 749-758.
37. Ling B. and Wei-Guo Z. (2006), “p53: Structure, Function and Therapeutic Applications”, Journal of Cancer Molecules, 2(4), pp.141-153.
38. Masha V. P., Chen K., Oleg L., Rachel B., Maria L., Jinwoo A., In-Ja L. B., Ronen G., Melissa M., Andrew Z., Lewis M. B., Assaf F. and Carol P. (2010), “The C terminus of p53 binds the N-terminal domain of MDM2”, Nature structural and molecular biology, 17(8), pp. 982-989.
39. May P., May E. (1999), “Twenty years of p53 research: structural and functional aspects of the p53 protein”, Oncogene, 18, pp. 7621-7636.
40. Olivier M. (2010). Cold Spring Harb Perspect Biol, 2, pp. a001008. 41. Petitjean A. (2007), Hum Mutat, 28, pp. 622–629.
42. Pingzuo L., Anukanth A., Xiu-Gong G., Kuppusamy I., Vincent V. S., Nejat D. and Renugopalakrishnan V. (2007), “Expression of Recombinant Proteins in
43. Plummer M., deMartel C., Vignat J., Ferlay J., Bray F. and Franceschi S. (2016). “Global burden of cancers attributable to infections in 2012: a synthetic analysis”,
Lancet Glob Health, 4(9), pp. 609-616.
44. Ryu J., Lee H. J., Kim K. A., Lee J. Y., Lee K. S., Park J. and Choi S. Y. (2004), “Intracellular Delivery of p53 Fused to the Basic Domain of HIV-1 Tat”, Mol. Cells, 17(2), pp. 353-359.
45. Sanjay D. S., Hong X., Scott W. and Divaker C. (2001), “The Gene Encoding p202, an Interferon-inducible Negative Regulator of the p53 Tumor Suppressor, Is a Target of p53-mediated Transcriptional Repression”, The Journal of Biological Chemistry, 276(1), pp. 298–305.
46. Shinsuke K.,Yuki I., Aiko K., Amador A., Takehiro Y., Shiro N. and Molly K. M. (2001), “Binding to the naturally occurring double p53 binding site of the Mdm2
promoter alleviates the requirement for p53 C-terminal activation”, Nucleic Acids Research, 29(9), pp. 1989-1993.
47. Souhami R., Tobias J. (2005), Cancer and its management, 5, pp. 9-12. 48. Stefan S. (2000), Basic Techniques in Molecular Biology, pp. 1-421.
49. Stewart B. W., Wild C. P. (2014), “Lyon: International Agency for Research on Cancer”, World cancer report.
50. Sue M. P., Mariana L. F., Brian M. and Linda M. H. (2005), “Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system”, Yeast, 22, pp. 249–270.
51. Walter D. F., Daniel T. P., Richard H. K., Woodring E. W. and Jerry W. S. (1992 ), “A Transcriptionally Active DNA-Binding Site for Human p53 Protein Complexes”, Molecular and cellular biology, 12(6), pp. 2866-2871.
52. Yan H., Xiao-Lin M., Jin-Ping X., Wei L. and Jian W. (2005), “Cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme PM246 in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 43, pp. 18–25.
53. Yu W., Yuangang L., Laura L., Zoe M. and Molly K. M. (1994), “Wild-type alternatively spliced p53: binding to DNA and interaction with the major p53 protein in vitro and in cells”, The EMBO Journal, 13(20), pp. 4823-4830.
54. Yun W., John F. S., Dorothy P., Kristine M. and Peter T. (1995), “Interaction of p53 with Its Consensus DNA-Binding Site”, Molecular and Cellular Biology,
15(4), pp. 2157–2165.
55. Zhaorong W., Yueju W., Gangqiang L., Xiaokun L. and Dehu L. (2008), “Optimized gene synthesis, expression and purification of active salivary
plasminogen activator a2 (DSPAa2) of Desmodus rotundus in Pichia pastoris”, Protein Expression and Purification, 57, pp. 27–33.
56. http://www.snapgene.com.
57. http://www.thermoscientific.com/en.
58. https://www.cancer.org.
59. https://www.gelifesciences.com.
PHỤ LỤC
PL 1. Trình tự của gen TAT-p53-His sau cải biến
> TAT-p53-His GAATTCTACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTATGGAAGAACCCCAGT CCGATCCTTCTGTGGAGCCACCTTTGTCCCAAGAAACCTTCTCTGACCTTTGGAAG TTATTGCCAGAGAATAATGTGTTGTCCCCATTGCCTTCCCAGGCTATGGATGACTT AATGTTATCTCCTGACGACATCGAACAGTGGTTCACTGAGGACCCAGGACCTGAT GAAGCCCCAAGGATGCCTGAGGCCGCTCCACGTGTCGCCCCAGCTCCTGCTGCCC CAACCCCTGCTGCCCCAGCTCCAGCCCCATCTTGGCCATTGTCTTCCTCTGTCCCAT CCCAAAAAACTTACCAAGGATCTTACGGTTTTCGTTTAGGATTCCTTCACTCCGGT ACCGCCAAATCCGTCACTTGTACCTACTCCCCTGCCTTAAATAAGATGTTTTGCCA ATTGGCTAAGACCTGTCCTGTCCAGTTGTGGGTTGACTCCACCCCACCTCCAGGAA CTAGAGTCAGAGCTATGGCTATCTACAAACAATCCCAACACATGACTGAAGTTGT CAGAAGATGCCCACATCATGAGAGATGCTCTGACTCCGATGGATTGGCCCCACCT CAGCACTTAATTCGTGTTGAAGGTAATTTGCGTGTTGAATACTTGGATGATAGAAA TACCTTTCGTCATTCCGTGGTCGTTCCATATGAACCTCCTGAAGTTGGATCTGATT GTACTACCATTCACTATAACTATATGTGTAACTCCTCTTGTATGGGAGGTATGAAT AGACGTCCTATTTTGACCATCATTACTTTAGAAGATTCCTCTGGTAACTTATTGGG TCGTAATTCCTTTGAAGTCCATGTTTGCGCTTGTCCAGGTCGTGATCGTAGAACTG AGGAAGAAAATTTGAGGAAGAAAGGTGAACCTCACCATGAATTACCACCAGGAT CCACCAAAAGAGCTTTATCTAACAACACCTCTTCCTCACCACAGCCAAAGAAGAA ACCACTTGACGGTGAGTATTTCACTCTTCAAATTAGAGGTCGTGAAAGATTCGAG ATGTTTAGAGAGTTGAACGAGGCTCTTGAATTAAAAGACGCCCAAGCTGGTAAAG AACCAGGAGGCTCCAGGGCTCACTCATCTCATTTGAAGTCCAAAAAGGGACAGTC CACTTCAAGACACAAAAAGTTAATGTTCAAGACCGAAGGTCCAGATTCAGATCAT CATCATCATCATCATTGATTTCTAGA
PL 2. Kết quả kiểm tra chỉ số phù hợp CAI
Hình PL 1. Kết quả kiểm tra chỉ số CAI trước khi cải biến trình tự p53
PL 3. Cấu trúc promoter của gen mdm2
Hình PL 3. Cấu trúc 2 promoter của gen mdm2 [6]
PL 4. Vị trí bám của p53 trên promoter của mdm2
Hình PL 4. Vị trí của hai trình tự bám đặc hiệu của p53 trên promoter mdm2 [6]