CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Biến nạp DNA vào tế bào nấm men bằng phương pháp xung điện
Nguyên lý của phương pháp biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào nấm men bằng xung điện [42, 57] là dựa vào tác dụng của nguồn điện, thành tế bào nấm men thay đổi, tạo điều kiện cho DNA plasmid đi vào dễ dàng. Vector tái tổ hợp được cài vào hệ gen của nấm men tại điểm AOX1. Các bước tiến hành của phương pháp xung điện được thực hiện như sau: tế bào khả biến P. pastoris X33 đã được chuẩn bị trước đó bằng cách ly trích mợt khuẩn lạc nấm men và nuôi cấy trong môi trường YPD lỏng, lắc qua đêm với vận tốc 250 vòng/phút ở 30oC. Tới ngày thứ hai thì 0,2% dịch ni qua đêm được chuyển vào 20ml YPD lỏng, ni lắc trong vịng 16-18 giờ cho tới khi OD600 nm đạt tới 1,4-1,6. Dịch nuôi được để lạnh 30 phút cho ổn định và sau đó được ly tâm 4.000 vịng/phút trong 5 phút để thu tế bào. Tế bào được rửa với H2O cất vơ trùng, sau đó ly tâm 4.000 vịng/phút trong 5 phút để thu tế bào lần hai. Bước này được lặp lại hai lần. Tủa tế bào được bổ
sung lượng sorbitol 1M vừa đủ và lắc đều cho tới khi hịa tan. Sau đó hỗn hợp được ly tâm 4.000 vòng/phút trong 5 phút để thu tế bào và hòa tan trở lại trong 100μl sorbitol 1M để chuẩn bị cho biến nạp. Dịch tế bào khả biến được bổ sung plasmid tái tổ hợp đã xử lý với SacI. Hỗn hợp được để ổn định trong 15 phút, sau đó chuyển vào cuvette (khử trùng) để xung điện với điều kiện: 1,5kV, 25uF, 200Ω. 1ml sorbitol 1M được bổ sung ngay vào hỗn hợp khi xung điện hoàn thành và để lạnh trong 15 phút. Tồn bợ dịch biến nạp được chuyển sang ống eppendorf khử trùng, ủ 30oC trong 1-2 giờ. Dịch biến nạp được trải trên đĩa YPDS agar 1,5% chứa 100μg/ml zeocin, ủ 30oC trong vòng 3-5 ngày. Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch được nuôi trong mơi trường YPD có bổ sung zeocin 100μg/ml để tách DNA kiểm tra sự có mặt của gen chèn (Mục 2.2.6).