CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và hóa chất
2.1.1. Vật liệu
Vector biểu hiện p53 tái tổ hợp pPICZαA-TAT-p53-His được nghiệm thu từ kết quả nghiên cứu trước của nhóm chúng tơi đã được cơng bố trên Tạp chí Khoa học của Đại học Quốc Gia (2016) (32(1S): 336-343).
DNA tổng số của người được cung cấp bởi Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein (KLEPT).
Chủng vi khuẩn E. coli DH5α và nấm men Pichia pastoris X33 được cung cấp
bởi hãng Invitrogen, Hoa Kỳ.
2.1.2. Hóa chất
Enzyme cắt giới hạn SacI, Taq DNA polymerase, thang chuẩn DNA 1 kb được
mua từ hãng Biolabs, thang chuẩn Unstained Protein Molecular Weight Marker được mua từ hãng Thermo.
Bộ kit tinh sạch DNA từ gel agarose - GenJETT M Gel Extraction Kit và bộ kit tinh sạch DNA plasmid - GenJETT M Plasmid Miniprep Kit được mua từ hãng Thermo.
Gel tinh sạch Niken – Sepharose được mua từ hãng Gelifesciences.
Các hóa chất cơ bản khác sử dụng cho sinh học phân tử đều đạt độ tinh khiết cần thiết dùng cho nghiên cứu.
2.1.3. Các đoạn oligonucleotide
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng các đoạn mồi cho các phản ứng PCR nhân bản DNA với trình tự nucleotide như sau:
Bảng 2.1. Trình tự của các đoạn oligonucleotide Tên Trình tự Sản phẩm PCR Tên Trình tự Sản phẩm PCR AOXI-Fw 5’ – GACTGGTTCCAATTGACAAGC – 3’ 2.200 bp và 1.800 bp AOXI-Rv 5’ – GCAAATGGCATTCTGACATCC – 3’ EcoRI-Fw 5’- ATGATATCGAATTCTACGGTCG - 3’ 1247 bp XhoI-Rv 5’- TACTCGAGTCTAGAAATCAATGATG -3’ proMDM2-Fw 5' - CTAGTGTGAACGCTGCGCGTAG – 3 187 bp proMDM2-Rv 5' - GCCACTGAACACAGCTGGGAA - 3' DCmdm2-Fw 5'- GGTAAGCACCGACTTGCTTG -3' 200 bp DCmdm2-Rv 5’-TCTTGTTCCGAAGCTGGAATC-3’
2.1.4. Thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tủ an toàn cấp II (Labtech); tủ ấm; bể ổn nhiệt Memmert WNB14; máy lắc cỡ lớn; máy đo OD Bionate 3, máy GeneAmp® PCR System 9700 (Thermo); Gene Pulser Xcell Total System, Bio-rad.
Máy ly tâm 5417R (Eppendorf); máy ly tâm 3k30 của hãng Sigma; máy đo Nanodrop của Spectrophotometer. Thiết bị điện di ngang và hệ thống chụp ảnh điện di Geldox, hệ thống điện di protein của hãng Biorad.
Các thiết bị, máy móc cần thiết khác được cung cấp bởi Phịng thí nghiệm Bợ mơn Di truyền học, Khoa Sinh học và Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein (KLEPT).
2.1.5. Các môi trường nuôi cấy
Các loại môi trường đã dùng trong nghiên cứu này đều được pha theo hướng dẫn của các bài thí nghiệm chuẩn có thành phần, nồng đợ được tóm tắt trong bảng 2.2 [57].
Bảng 2.2. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy
Môi trường Thành phần
BMM 1,34% YNB; 4.10-5 Biotin; 0,1M Phosphate Buffer, pH 6,0; 0,5% (v/v) Methanol
BMMY YP; 1,34% YNB; 4.10-5 Biotin; 0,5% Methanol 0,1 M Phosphate Buffer, pH 6,0;
MMY YP; 1,34% YNB; 4.10-5 Biotin; 0,5% Methanol
LB 1% Peptone; 0,5% Cao nấm men; 1% Sodium chloride YP 2% Peptone; 1% Cao nấm men
YPD 2% Peptone; 1% Cao nấm men; 2% Glucose
YPDS 2% Peptone; 1% Cao nấm men; 2% Glucose; 0,1M Sorbitol YPM 2% Peptone; 1% Cao nấm men; 0,5% Methanol
YPDM 2% Peptone; 1% Cao nấm men; 2% Glucose; 0,5% Methanol
2.1.6. Các dung dịch và đệm
Các dung dịch và đệm đã sử dụng trong thí nghiệm đều được pha theo các quy trình và cơng thức chuẩn, có thành phần và nồng đợ như đã trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần các loại dung dịch và đệm
Dung dịch Thành phần, nồng độ
Bradford Buffer 5% Ethanol; 0,01% Coomassie Brilliant Blue G250; 8,5% Phosphoric Acid
EMSA buffer 5X 100mM HEPES (pH 7,9); 125mM KCl; 0,5mM EDTA; 50% Glycerol; 10mM MgCl2; 0,5 mM DTT; 0,1 mg BSA Breaking buffer 2% Triton X-100; 1% SDS; 100mM NaCl; 10mM Tris, pH
8,0; 1mM EDTA, pH 8,0.
4X Tris-HCl/SDS pH 8.8 Đệm 1,5M Tris-HCl, pH 8,8; 0,4% SDS 4X Tris-HCl/SDS pH 6.8 Đệm 0,5M Tris-HCl, pH 6,8; 0,4% SDS 30% Polyacrylamide 30% Acrylamide; 0,8% Bis-acrylamide CI 24 Chloroform : 1 Isopropanol (v/v) Dung dịch nhuộm CBB 0,1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue;
30% (v/v) Methanol; 10% (v/v) Acid Acetic
Đệm điện di protein 20mM Tris-HCl; 192mM Glycine; 0,1% SDS, pH 8,3 Đệm 5X TBE 1,1M Tris; 25mM EDTA ; 900mM Borate, pH 8,0 Đệm gắn cột N1 50mM NaH2PO4; 0,5M NaCl ; 5mM Imidazole, pH 6,0 Đệm rửa cột N2 50mM NaH2PO4 ; 0,5M NaCl ; 20mM Imidazole, pH 6,0 Đệm đẩy N3 50mM NaH2PO4 ; 0,5M NaCl ; 200mM Imidazole, pH 6,0