Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (o
C) Thời gian Chu kỳ
1 T ng hợp cADN 55 30 phút 1 Duỗi mạch 94 2 phút 2 Duỗi mạch 94 15 giây 30 Gắn mồi 55 30 giây T ng hợp sợi m i 72 1 phút 3 Hoàn ch nh 72 10 phút 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
- Điện di kiểm tra s n ph m PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sơi trong lị vi sóng, để nguội đến khoảng 40oC, đ thạch có số giếng tương ứng số mẫu c n điện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8 l sản phẩm RT-PCR - Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR vào các giếng v i thể tích 3l maker 100bp và 10 l sản phẩm PCR mỗi giếng.
- Điện di hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
- Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
2.4.7. Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Các bư c của quá trình làm tiêu bản vi thể như sau:
Chuẩn bị d ng và hóa hất
- Dụng cụ: máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm, máy cắt mảnh mycrotom, phiến kính, lamen, dao, kéo, panh, kẹp, cốc đựng hóa chất.
- Hóa chất: focmol 10%, cồn các loại, xylen paraffin, thuốc nhuộm eosin, hematoxylin.
Chuẩn bị và ố định bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm c n nghiên cứu của lợn bệnh lấy từ các vùng dịch PRRS, được cắt gọn, đánh dấu bằng bút chì cho từng mẫu bệnh phẩm rồi ngâm ngập vào dung dịch focmol trung tính 10%. Thơng thường thể tích của focmol phải đảm bảo gấp ít nhất 10 l n thể tích của bệnh phẩm ngâm trong nó. Sau 10 -1 ngày lấy bệnh phẩm ra để làm các bư c tiếp theo.
Vùi bệnh phẩm
Tiến hành l n lượt các bư c sau:
- Cắt bệnh phẩm: lấy bệnh phẩm đã ngâm trong focmol 10%, cắt thành các miếng nhỏ 3-5mm, chú ý cắt các miếng bệnh phẩm sao cho có hình dạng g n giống v i các khí quan tự nhiên. Ví dụ mẫu ph i nên cắt tạo ra khối hình chóp có các mặt là tam giác, mẫu hạch nên cắt tạo ra hình trịn,…
- Rửa focmol: rửa dư i vịi nư c chảy nhẹ trong 24h. - Đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động.
Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600 C 1:00 2 Cồn 600 C 1:00 3 Cồn 700 C 1:30 4 Cồn 800 C 1:30 5 Cồn 960 C 1:30 6 Cồn 1000 C 1:30 7 Cồn 1000 C 1:30 8 Cồn 1000 C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00
Đ bl k
Đúc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dán mảnh và ố định tiêu bản
Cắt mảnh: bằng máy microtom.
Tãi mảnh: dàn lát cắt bằng phẳng trên phiến kính trong nư c ấm 480
C. Sau đó để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khô lát cắt bệnh phẩm gắn chặt lên phiến kính thì ta đem nhuộm.
Nhuộm tiêu bản
Các bư c tiến hành
+ Khử parafin: cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 6h
Xylen II: 6h
Xylen III: 12h
+ Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 l n (mỗi l n 1 phút) Cồn 9 0 : 1 l n Cồn 700 : 1 l n Cồn 00 : 1 l n
+ Khử cồn: cho dư i vòi nư c chảy 1 phút. + Nhuộm haematoxylin (nhuộm nhân)
Nhỏ hematoxilin ngập tiêu bản trong phút, rửa nư c. Sau đó cho tiêu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 00: 1 l n Cồn 700: 1 l n
Cồn 9 0: 1 l n Cồn 1000: 2 l n Rửa tiêu bản
+ Nhuộm eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ eosin ngập tiêu bản khoảng -10 phút, rửa nư c. Cho tiêu bản qua hai lọ cồn 1000
mỗi lọ 1 phút.
+ Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản đi qua xylen.
Gắn Baum anada
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản, lưu khi gắn lamen sao cho khơng cịn bọt khí trên ph n bệnh phẩm đã nhuộm. Sau đó tiến hành đọc tiêu bản trên kính hiển vi quang học.
2.4.8. Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch
Phương pháp nhuộm hố mơ miễn dịch (Immunohistochemistry -
IHC) là phương pháp m i có độ chính xác cao, dùng phương pháp này
có thể phát hiện được virus kháng nguyên tồn tại trong mô bào. Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch được thực hiện dựa trên nguyên l của sự kết hợp giữa kháng nguyên v i kháng thể đặc hiệu và được phát hiện bằng chất ch thị màu. Kết quả đánh giá mức độ nặng nhẹ khác nhau tùy thuộc vào sự xuất hiện các điểm, các đám màu vàng nâu trên tiêu bản. Khi có sự kết hợp giữa kháng nguyên v i kháng thể đơn dịng đặc hiệu thì xuất hiện các đám vàng nâu nghĩa là phản ứng dương tính hay t chức có virus khu trú. Các đám màu vàng nâu càng nhiều và càng đậm chứng tỏ virus tập trung đó càng nhiều. Phương pháp IHC có quy trình tẩm đúc bằng parafin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể (đã trình bày trong ph n 2.4.7).
Sau khi có tiêu bản bệnh phẩm, q trình nhuộm hóa mơ miễn dịch IHC được thực hiện qua các bư c sau.
* Các bước nhuộm:
Bước 1: làm sạch tiêu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Sau khi cho chảy dư i vòi nư c rửa lại tiêu bản bằng nư c cất.
Bước 2: hoạt hoá enzym
Ngâm ngập tiêu bản trong dung dịch PBS và hấp ư t 1210
C/5 phút.
Bước 3: khử peroxydase nội sinh
Dùng H2O2 trong dung môi methanol (1H2O2 30%: 9 methanol). Ngâm tiêu bản trong 10 phút.
Bước 4: gắn kháng thể (KT)
Nhỏ 80 µl KT kháng PRRSV chuẩn/1tiêu bản. Để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua đêm.
Rửa tiêu bản bằng dung dịch PBS 3 l n ( phút/l n).
Bước 5: gắn kháng kháng thể
Nhỏ 2 giọt kháng kháng thể/1 tiêu bản. Để tủ ấm 370
C/1h.
Rửa PBS 3 l n ( phút/l n).
Bước 6: cho cơ chất
Ngâm tiêu bản trong dung dịch DAB khoảng 3-8 phút. Quan sát kết quả.
Bước 7: nhuộm nhân tế bào bằng hematoxylin (30 giây), làm sạch, gắn
2.4.9. Phương pháp xét nghiệm các chỉ tiêu huyết học
+ Các ch tiêu hồng c u, bạch c u của lợn mắc PRRS được đo bằng máy phân tích ch tiêu huyết học Celldyn 3700 của Khoa Thú y Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
+ Các ch tiêu GOT, GPT, được phân tích theo phương pháp Bergmeyer, đo bằng máy phân tích tự động Hitachi 704 của Nhật Bản. Ch tiêu Protein huyết thanh được định lượng bằng phản ứng Biuret, đo bằng máy khúc xạ kế v i bư c sóng 25nm. Các ch tiêu GOT, GPT và Protein huyết thanh đều được phân tích tại Khoa Hóa sinh của bệnh viện Trung ương Quân Đội 108.
2.4.10. Phương pháp xét nghiệm một số vi khuẩn kế phát trong ổ dịch PRRS
Các vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (App), Pasteurella multocida (P. multocida), Streptococcus suis (St. suis), Escherichia. coli (E. coli), Salmonella sp, Clostridium perfringens (Cl. perfringens). Được xét
nghiệm theo qui trình phân lập vi khuẩn thường qui của Bộ môn vi trùng, Viện Thú y Quốc gia.
2.4.11. Phương pháp thống kê sinh học dùng để xử lý số liệu c n thiết
+ Do đặc trưng của đối tượng nghiên cứu là không đồng nhất cho nên số lượng mẫu phải đủ l n.
- V i số liệu định tính (ví dụ như các loại tỷ lệ) thì số mẫu nghiên cứu n ≥ 100.
- V i số liệu định lượng (ví dụ như số lượng hồng c u, bạch c u) thì số mẫu nghiên cứu n ≥ 30.
+ Phương pháp so sánh. - So sánh các tỷ lệ.
Ví dụ: Đối tượng nghiên cứu 1 cứ n1 mẫu có m1 mẫu dương tính, ta có p1= 1 1 n m
Đối tượng nghiên cứu 2 cứ n2 mẫu có m2 mẫu dương tính, ta có p2= 2 2 n m So sánh t = 2 n ) p 1 ( p n ) p 1 ( p p p 2 2 1 1 1 2 1
Nếu t < 1,96 kết luận không khác nhau (ns).
Nếu 2, 8 t ≥ 1,96 kết luận khác nhau độ tin cậy 9 % kí hiệu (**) Nếu t ≥ 2, 8 kết luận khác nhau độ tin 99% kí hiệu (***)
- So sánh hai số trung bình.
Ví dụ: Đối tượng nghiên cứu 1 cứ n1 mẫu có X1, phương sai 2 1
S . Đối tượng nghiên cứu 2 cứ n2 mẫu có X2 phương sai S22.
Trong đó 1 n ) x xi ( S , n x X 2 2 . So sánh t = 2 n S n S x x 2 2 1 2 1 2 1
Nếu t < 1,96 kết luận không khác nhau (ns)
Nếu 2, 8 > t ≥ 1,96 kết luận khác nhau độ tin 9 % kí hiệu (**) Nếu t ≥ 2, 8 kết luận khác nhau độ tin 99% kí hiệu (***).
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU DIỄN BIẾN DỊCH PRRS TẠI MỘT SỐ ĐỊA PHƯƠNG.
3.1.1. Diễn biến tình hình dịch PRRS các tỉnh vùng tả ngạn sông Hồng từ năm 2007-2010
Nhiều năm liên tiếp từ 2007 đến nay, dịch PRRS xảy ra triền miên trên miền Bắc nư c ta dường như theo qui luật. Dịch chia làm hai đợt trong năm, đợt 1 dịch xuất hiện từ cuối tháng 2 đ u tháng 3 dương lịch, đợt 2 từ tháng 10 dương lịch cho đến hết năm. Đặc điểm là dịch bùng phát tại một địa phương nào đó, rồi lây lan ra các xã, huyện và t nh lân cận nếu có thêm yếu tố bán chạy lợn ốm và vận chuyển trái phép thì dịch PRRS lây lan rất nhanh. Theo địa l hành chính dịch có thể ch xảy ra một vài xã, tuy nhiên trong thực tế thì việc lây lan dịch bệnh diễn ra trên địa bàn rất rộng. Trong quá trình nghiên cứu đề tài, chúng tôi kết hợp v i cơ quan Thú y vùng II, liên tục theo dõi tình hình dịch PRRS các t nh thuộc vùng tả ngạn sông Hồng (Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phịng, Hải Dương, Hưng n, Thái Bình). Chúng tôi t ng hợp diễn biến dịch PRRS từ năm 2007-2010, theo kết quả bảng 3.1.
Bảng 3.1. Diễn biến tình hình dịch PRRS các tỉnh vùng tả ngạn sông Hồng từ năm 2007-2010
(Số liệu được tổng hợp theo báo cáo của cơ quan Thú Y vùng II)
Năm Số huyện có dịch Số xã có dịch Số thơn có dịch Số hộ có dịch Số lợn ốm (con) Số lợn chết và tiêu hủy (con) 2007 36 231 602 4.286 53.030 18.900 2008 10 55 105 3.325 13.063 12.314 2009 6 12 15 42 816 303 2010 55 385 1.155 8.967 124.318 53.525 T ng 107 683 1.867 16.620 191.227 85.042
Kể từ khi xuất hiện vụ dịch đ u tiên tại Hải Dương vào tháng 3 năm 2007, ngay sau đó dịch bệnh lây lan nhanh và kéo dài đến hết năm, hậu quả là PRRS tr thành vấn để thời sự nóng bỏng, gây thiệt hại rất l n về kinh tế. Có t i 3.030 con lợn mắc bệnh trong đó có 18.900 con lợn chết và buộc phải tiêu hủy. Từ năm 2008 - 2010, dịch vẫn âm th m n ra nhiều nơi, v i nhiều mức độ khác nhau. Đặc biệt vào năm 2010 dịch PRRS lại hồnh hành rất mạnh, có thể nói dịch bệnh đã làm kiệt quệ ngành chăn nuôi lợn Việt Nam, v i một lượng l n lợn nái bị chết, làm cho nguồn cung cấp con giống bị thiếu hụt nghiêm trọng. Sau bốn năm dịch PRRS lưu hành và tàn phá, ch riêng các t nh thuộc tả ngạn sơng Hồng đã có 191.227 con lợn ốm, trong đó số lượng lợn chết và buộc phải tiêu hủy là 8 .042 con. Nay dịch PRRS vẫn diễn ra hàng năm, gây chết nhiều lợn, v i tính chất lây lan mạnh và ngày càng phức tạp hơn. Tuy chúng ta đã có nhiều biện pháp phịng chống, nhưng PRRS vẫn đang là thách thức l n đối v i ngành chăn ni.
Trong q trình nghiên cứu, chúng tơi chọn t nh có ngành chăn ni lợn tương đối l n thuộc vùng tả ngạn sơng Hồng và có báo cáo chi tiết trong từng vụ dịch PRRS là: Bắc Giang, Hải Phòng, Bắc Ninh, Hải Dương và Hưng Yên. Số lợn mắc PRRS từ năm 2007-2010 các t nh này, được trình bày bảng 3.2.
Bảng 3.2. Tổng hợp số lợn mắc bệnh trong vùng dịch PRRS từ năm 2007 – 2010 địa bàn nghiên cứu
Năm T nh
Số lợn mắc bệnh trong năm (con)
2007 2008 2009 2010 T ng Bắc Giang 13.597 - 604 3.962 18.163 Hải Phòng 461 - - 5.021 5.482 Bắc Ninh 5.274 - - 55.462 60.736 Hải Dương 15.804 674 - 9.390 25.868 Hưng Yên 6.132 - 212 24.305 30.649 Tổng 41.268 674 816 98.140 140.898
Năm 2007 là năm đ u tiên chúng ta đối mặt v i dịch PRRS, vụ dịch đ u tiên được xác định xảy ra ngày 12/3/2007 tại Hải Dương, sau đó lây lan ra các t nh khác trong vùng. Theo số liệu mà chúng tôi t ng hợp được năm 2007, Hải Dương có 15.804 con lợn mắc bệnh, đây là t nh có số lợn mắc bệnh cao nhất trong số các địa phương mà chúng tôi theo dõi, tiếp theo là Bắc Giang v i số lợn mắc bệnh là 13. 97 con. Hải Phịng, Bắc Ninh và Hưng n có số lợn mắc bệnh ít hơn, dao động từ 461-6.132 con. Tùy theo từng t nh v i mức độ diễn biến khác nhau, đã góp ph n làm dịch lan rộng và khó kiểm sốt. Thực tế thì từ năm 2007, dịch PRRS đã bắt đ u tr thành mối đe dọa, không thể xem thường cho ngành chăn nuôi lợn Việt Nam. Năm 2008, trong số các t nh mà chúng tơi theo dõi ch có Hải Dương báo cáo có dịch PRRS v i 674 con lợn mắc bệnh, các t nh khác khơng có dịch xảy ra. Có lẽ do dư âm về dịch
bệnh từ 2007 còn để lại, các địa phương đã thức được tính nguy hiểm của dịch bệnh và đã có phương án phịng và khống chế dịch, cho nên năm 2008 có thể được coi là khá an tồn về dịch PRRS. Năm 2009 dịch cũng ch xảy ra hai t nh Bắc Giang và Hưng Yên làm cho 816 con lợn mắc bệnh. Đến năm 2010 dịch PRRS ồ ạt quay lại trên qui mơ rộng, có thể đây là vụ dịch nghiêm trọng nhất, h u hết các t nh mà chúng tôi theo dõi đều chịu hậu quả nặng nề do dịch PRRS gây ra. Riêng đợt dịch năm 2010, t nh Bắc Ninh có t i .462 con lợn mắc bệnh, t nh Hưng Yên có 24.30 con lợn mắc bệnh. Số lợn bệnh của các t nh còn lại dao động từ 3.962- 9.390 con.
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 Bắc Giang Hải Phòng Bắc Ninh Hải Dương Hưng Yên Hình 3.1. Biểu đồ tổng hợp số lợn mắc bệnh trong vùng dịch PRRS từ năm 2007 – 2010 địa bàn nghiên cứu
T ng hợp số liệu qua các đợt dịch từ 2007- 2010. Ở t nh mà chúng tôi theo dõi có t i 140.898 con lợn mắc bệnh, trong đó riêng năm 2010 đã chiếm 98.140 con. Bắc Ninh là t nh có số lợn mắc bệnh nhiều nhất, sau đó là Hưng Yên. Qua những số liệu phân tích trên đây chúng ta có thể nhận xét rằng dịch PRRS xảy ra ngày càng tr m trọng, rất khó kiểm sốt, nếu chúng ta khơng có biện pháp và chiến lược phịng bệnh thì PRRS chắc chắn sẽ cịn là hiểm họa của ngành chăn ni lợn nư c ta.
3.1.2. Tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu đàn được khảo sát trong địa bàn nghiên cứu
Khi nghiên cứu về dịch PRRS ngoài những diễn biến phức tạp về tính chất gây bệnh, khả năng lây lan rộng,... Chúng tôi nhận thấy rằng lợn các giai đoạn phát triển khác nhau thì có tỷ lệ mắc bệnh khác nhau. Khảo sát vấn đề này chúng tôi thu được kết quả bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu đàn được khảo sát trong địa bàn nghiên cứu
TT T nh T ng chung
Lợn thịt Lợn con Đực giống Lợn nái
Số lượng (con) Tỷ lệ (%) Số lượng (con) Tỷ lệ (%) Số lượng (con) Tỷ lệ (%) Số lượng (con) Tỷ lệ (%) 1 Bắc