1. .2 Khuyến cỏo cụng tỏc phũng, chống dịch PRRS tại Việt Nam
2.3.2.Một số nghiờn cứu về PRRS trờn lợn gõy bệnh thực nghiệm
Tại trung tõm chẩn đoỏn Thỳ y trung ương đó thực hiện gõy bệnh thực nghiệm để đỏnh giỏ hiệu lực vaccine PRRS. Kết quả cho thấy sau khi nhỏ vào mũi mỗi con lợn thớ nghiệm 1ml huyễn dịch chứa virus cường độc PRRS cú 106TCID50 thỡ lợn của cả 2 lụ miễn dịch và đối chứng đều cú phản ứng sốt từ ngày thứ 2. 100% số lợn nhúm đối chứng cú cỏc biểu hiện sốt, mệt mỏi, giảm ăn, tỏo bún, th khú, tiờu chảy. Trong khi lợn nhúm miễn dịch, tỷ lệ lợn cú cỏc biểu hiện giảm ăn, mệt mỏi, tỏo bún, tiờu chảy, ho, khú th , chiếm từ 20 đến 40%. Tỷ lệ lợn cú cỏc biểu hiện khỏc như tiờu chảy, cú dử mắt,
chảy nư c mũi nhúm đối chứng đều cao hơn hẳn so v i nhúm miễn dịch. Ở nhúm đối chứng, cỏc biểu hiện thường xuất hiện tu n tự sốt, mệt mỏi, giảm ăn, tỏo bún, da ban đỏ, cú dử mắt, chảy nư c mũi, ho, khú th , tiờu chảy. Nhúm đối chứng, sốt mệt mỏi, tỏo bún thường xuất hiện vào ngày thứ 3- sau gõy bệnh; ho, khú th thường xuất hiện từ ngày thứ 7, tiờu chảy xuất hiện đồng thời hoặc sau khoảng vài ngày. Hiện tượng tai xanh xuất hiện vào khoảng ngày thứ 8. Lợn nhúm miễn dịch cỏc biểu hiện trờn mức độ nhẹ (Trung tõm chẩn đoỏn Thỳ y Quốc gia, 2009).
2.3.2.1. iễn biến thõn nhiệt khi gõy bệnh thực nghiệm
Diễn biến nhiệt độ của hai lụ cú sự khỏc biệt, từ ngày thứ 3 và ngày thứ 8 sau khi gõy nhiễm, thõn nhiệt bỡnh quõn của lợn lụ đối chứng tăng cao hơn rừ rệt (40,30
C và 41,70C) so v i lợn lụ thớ nghiệm được tiờm vaccine (40,10
C và 40,60C).
So sỏnh v i trư c khi gõy độc cho thấy, thõn nhiệt lợn gõy bệnh tăng cao hơn từ 1,0 - 1,3°C (Trung tõm chẩn đoỏn Thỳ y Quốc gia, 2009).
2.3.2.2. iễn biến cỏc ch số huyết học khi gõy bệnh thực nghiệm
Đối v i lợn lụ miễn dịch: Số lượng bạch c u đều cú xu hư ng giảm vào ngày thứ 4, nhưng sau đú số lượng bạch c u trung bỡnh của lợn tăng d n lờn rồi n định xung quanh ngưỡng sinh l ban đ u từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 10. Ngày thứ 14, số lượng bạch c u trung bỡnh tăng hẳn so v i trư c và duy trỡ mức cao hơn đến ngày thứ 21, nhưng vẫn nằm trong điều kiện sinh l bỡnh thường.
Cũn lợn lụ đối chứng: Giống v i lợn lụ miễn dịch, số lượng bạch c u lợn đối chứng cũng cú xu hư ng giảm từ ngày thứ 4, nhưng lượng bạch c u trung bỡnh tiếp tục giảm đến ngày thứ 10, ch tăng ngày thứ 14 và mức giảm bạch c u nhiều hơn so v i lụ miễn dịch. Sự biến động bạch c u trung bỡnh của của 2 lụ miễn dịch và đối chứng khỏc nhau rừ rệt, trong khi biến động bạch c u trung bỡnh lợn miễn dịch tương đối n định, khụng cú sự biến động mạnh, thỡ
diễn biến bạch c u trung bỡnh của lợn lụ đối chứng biến động mạnh, giảm đến tận ngày thứ 10 và đến ngày thứ 21 tăng mạnh rừ rệt so v i trư c (Trung tõm chẩn đoỏn Thỳ y Quốc gia, 2009).
2.3.2.3. Khỏng thể miễn dịch
Lợn lụ miễn dịch cú hiện tượng hiệu giỏ khỏng thể trung bỡnh giảm vào ngày thứ 7, tăng lờn ngày thứ 14, nhưng đến ngày thứ 21 lượng hiệu giỏ khỏng thể đều cao hơn so v i trư c. Khỏng thể đặc hiệu được sản sinh sau khi tiờm vaccine của lợn miễn dịch đó trung hũa v i virus gõy nhiễm, điều đú đó thể hiện hiệu giỏ khỏng thể trung bỡnh ngày thứ 7 thấp hơn so v i trư c. Hiệu giỏ khỏng thể tăng cao ngày 21, cú thể l giải do những lợn được tiờm vaccine, khi cú sự xõm nhập của virus vào l n sau sẽ kớch thớch hệ thống miễn dịch qua phản ứng trớ nh miễn dịch làm cho hàm lượng khỏng thể tăng cao.
Cũn lợn đối chứng, đến ngày thứ 14 cú hiệu giỏ khỏng thể, đến ngày 21 thỡ lượng khỏng thể đó tăng cao hơn nhiều so v i ngày thứ 14. Nhưng so v i lợn lụ miễn dịch thỡ hiệu giỏ khỏng thể của lợn đối chứng thấp hơn.
2.3.2.4. Sự đào th i virus
- Ngày thứ 4 sau gõy bệnh, lợn lụ miễn dịch và lụ đối chứng đều phỏt hiện cú PRRSV trong mỏu.
- Ngày thứ 7, tất cả lợn thớ nghiệm đều phỏt hiện thấy cú PRRSV trong mỏu, nhưng cỏc mức độ khỏc nhau và lợn lụ miễn dịch lượng virus trong huyết thanh ớt hơn lợn lụ đối chứng.
- Ngày thứ 10, lượng virus trong huyết thanh cao hơn so v i ngày thứ 7 lụ miễn dịch. Ở lụ đối chứng lượng virus huyết giảm so v i ngày thứ 7.
- Ngày thứ 14, ngược lại v i ngày thứ 10 thỡ lụ miễn dịch lượng virus huyết giảm, và lụ đối chứng lượng virus huyết tăng.
Ngày thứ 21, cú 75% lợn lụ miễn dịch khụng tỡm thấy virus trong mỏu và mức virus huyết trung bỡnh cũn rất thấp. Trong khi đú, 50% lợn lụ đối chứng v i mức virus kiểm tra trong mẫu huyết thanh vẫn cũn cao (Trung tõm chẩn đoỏn Thỳ y Quốc gia, 2009).
2.3.2.5. Bệnh tớch khi gõy nhiễm thực nghiệm
Bệnh tớch đại thể:
Sau khi gõy bệnh, lợn của tất cả cỏc lụ thớ nghiệm và đối chứng đều cú cỏc bệnh tớch đại thể viờm ph i. Tuy nhiờn, bệnh tớch đại thể của ph i lợn của lụ miễn dịch được tiờm vaccine cú biểu hiện viờm nhẹ hơn đối v i lợn của lụ đối chứng. Lụ lợn đối chứng ph i viờm, xuất huyết nặng và cú bệnh tớch khớ thũng cỏc thựy.
Bệnh tớch vi thể:
Cú thể quan sỏt thấy cỏc biến đ i bệnh tớch vi thể trờn ph i của lợn đối chứng và lợn được tiờm vaccine. Tuy nhiờn, cỏc bệnh tớch và mức độ biểu hiện cỏc bệnh tớch trờn lợn đối chứng tr m trọng hơn so v i lợn được tiờm vaccine:
Ph i lợn đối chứng: Chỳng tụi quan sỏt thấy hiện tượng viờm gian thựy ph i đa điểm từ mức độ nhẹ đến nặng v i cỏc đặc trưng: thõm nhiễm cỏc qu n thể tế bào đơn nhõn vào phế nang; tăng sinh, hoại tử cỏc tế bào ph i và cú nhiều hồng c u ngoài mạch quản và dịch thẩm xuất cỏc phế nang. Tại một số vựng ph i, tế bào biểu mụ phế quản tận trương phồng hoặc hoại tử. Đặc biệt hỡnh ảnh cỏc phế nang hẹp, khụng rừ. Bệnh tớch lợn chết vào ngày thứ 10 cho thấy ngoài tế bào viờm đơn nhõn cũn nhiều tế bào viờm đa nhõn trung tớnh xuất hiện, cú thể là do bội nhiễm vi khuẩn kế phỏt v i virus PRRS.
Ph i lợn thớ nghiệm: Chỳng tụi cũng quan sỏt thấy một số tế bào viờm, cú hoại tử nhẹ vỏch phế nang. Tuy nhiờn, hỡnh ảnh cỏc phế nang và vỏch phế nang vẫn cũn rừ ràng, cú khả năng hồi phục.
2.4. Vi khuẩn kế phỏt trong cỏc ổ dịch PRRS
Đó cú nhiều tài liệu núi đến cỏc bệnh cú thể tạo cơ hội cho bệnh PRRS, trong đú phải kể t i vai trũ của bệnh dịch tả lợn và bệnh cũi cọc lợn do Circo virus gõy ra. Việc khụng tiờm phũng đ y đủ bệnh dịch tả lợn đó làm tr m trọng cỏc vụ dịch PRRS. Người ta nhận thấy cỏc đàn lợn được tiờm phũng đõy đủ cỏc bệnh dịch tả lợn, bệnh tụ huyết trựng và bệnh thương hàn lợn thỡ
khả năng bị bệnh PRRS thấp hơn nhiều so v i cỏc đàn khụng được tiờm phũng bệnh trờn. G n đõy trong hội thảo bệnh PRRS Băngkok, Thỏi Lan, cỏc chuyờn gia về bệnh đó đưa ra nhiều dẫn chứng về kết luận trờn.
Song song v i cỏc bệnh đú, vai trũ của cỏc vi khuẩn kế phỏt cũng đó được đề cập t i. Trong một số dịch bệnh PRRS, người ta nhận thấy cú tỷ lệ người bị nhiễm Streptococcus suis tăng lờn. Nguyờn nhõn khụng phải là (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
những người này ăn thịt lơn bị bệnh PRRS, nhưng họ cú liờn quan t i ăn tiết canh lợn. Cú thể trong mụi trường dịch bệnh cú mặt St.suis do vậy đó xõm
nhập vào tiết canh lợn do đú những người này bị nhiễm vi khuẩn trờn là giỏn tiếp qua tiết canh lợn. Một số tỏc giả đó phõn lập được vi khuẩn này trong cỏc đợt dịch vừa qua và đề xuất việc sử dụng vaccine một số vi khuẩn kế phỏt cho phũng bệnh PRRS.
Tỏc giả Nguyễn Hữu Nam, (2007) nghiờn cứu cỏc dịch PRRS một số địa phương của miền Bắc v i 30 mẫu bệnh phẩm được thu thập đó xỏc định được sự cú mặt của một số vi khuẩn thứ phỏt bao gồm Atinobacilllus pleuropneumoniae (App , ast ur lla mult ida, tr pt us suis, li, am n lla sp và Cl stridium p r ring ns. Nghiờn cứu cho thấy trong dịch
PRRS thỡ cỏc vi khuẩn núi trờn bội nhiễm theo tỷ lệ là Atinobacilllus pleuropneumoniae (63,3%), E.coli (53,3%), Pasteurella multocida (36,6%).
Tuy ch là vi khuẩn cơ hội thứ phỏt khi PRRSV xõm nhập m đường trờn cơ thể lợn bệnh, nhưng chỳng đó cú vai trũ nhất định trong việc gõy ra bệnh tớch cho lợn.
Tỏc giả Cự Hữu Phỳ, (2008) cũng đó nghiờn cứu phõn lập được cỏc chủng vi khuẩn như P. multocida, App, Mycoplasma, St. suis và E. coli . Hiện nay một đề tài cấp nhà nư c đó được nghiệm thu và một dự ỏn sản xuất thử nghiệm vaccine phũng bệnh viờm ph i lợn đang được tiến hành tại Viện Thỳ y quốc gia.
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIấN CỨU
Lợn cỏc lứa tu i mắc PRRS trong cỏc dịch.
Phạm vi nghiờn cứu của đề tài, chỳng tụi thực hiện nghiờn cứu đề tài này trong phạm vi cỏc t nh thuộc vựng tả ngạn sụng Hồng cú dịch PRRS từ năm 2007 – 2010 (Thỏi Nguyờn, Bắc Giang, Lạng Sơn, Bắc Ninh, Hải Dương, Quảng Ninh, Hải Phũng, Hưng Yờn, Thỏi Bỡnh)
Địa điểm nghiờn cứu
Đề tài của chỳng tụi được thực hiện trờn cơ s theo dừi tỡnh hỡnh dịch PRRS xảy ra một số t nh thuộc vựng tả ngạn sụng Hồng.
Mẫu bệnh phẩm được lưu giữ và làm thớ nghiệm tại Bộ mụn Bệnh lớ Khoa Thỳ y trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội.
Cỏc ch tiờu huyết học của lợn mắc PRRS được xột nghiệm tại Khoa Thỳ y, Khoa Huyết học và Húa sinh của bệnh viện Trung ương Quõn đội 108.
Cỏc thớ nghiệm phõn lập và giỏm định vi khuẩn kế phỏt trong dịch PRRS, được thực hiện tại Bộ mụn Vi trựng của Viện Thỳ y Quốc gia.
2.2. NỘI DUNG NGHIấN CỨU
2.2.1. Nghiờn cứu diễn biến dịch tại một số địa phương
- Xỏc định tỷ lệ mắc PRRS
- Xỏc định tỷ lệ chết khi lợn mắc PRRS
2.2.2. Nghiờn cứu đặc điểm bệnh lớ chủ yếu của lợn mắc PRRS
- Nghiờn cứu triệu chứng lõm sàng khi lợn mắc PRRS - Nghiờn cứu bệnh tớch đại thể khi lợn mắc PRRS
- Nghiờn cứu bệnh tớch vi thể của một số cơ quan khi lợn mắc PRRS - Xỏc định một số vi khuẩn kế phỏt, gõy bệnh tớch khi lợn mắc PRRS
2.2.3. Nghiờn cứu một số chỉ tiờu huyết học khi lợn mắc PRRS
+ Thay đ i về hồng c u + Thay đ i về bạch c u
+ Thay đ i về GOT, GPT của mỏu lợn ốm + Thay đ i protein huyết tương
2.2.4. Áp dụng phương phỏp húa mụ miễn dịch (IHC) để chẩn đoỏn PRRSV PRRSV
2.3. NGUYấN LIỆU 2.3.1. Dụng cụ 2.3.1. Dụng cụ
+ Mỏy quay phim, mỏy chụp ảnh để phục vụ những nghiờn cứu về triệu chứng lõm sàng và bệnh tớch đại thể.
+ Bộ đồ m : Dao m , kộo, panh, tỳi đựng mẫu bệnh phẩm, dụng cụ lấy mỏu, dụng cụ chắt huyết thanh,… (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Mỏy PCR
+ Mỏy xử l bệnh phẩm tự động + Mỏy đỳc Block
+ Mỏy cắt tiờu bản microtom
+ Tủ ấm, tủ lạnh, mỏy làm lạnh block + Dụng cụ nhuộm và làm tiờu bản. + Kớnh hiển vi quang học.
2.3.2. Húa chất thớ nghiệm
+ Cỏc húa chất, mụi trường nuụi cấy tế bào: Mụi trường nuụi cấy DMEM, FBS, khỏng sinh, DMSO, trypsin, EDTA, PBS,…
+ Hoỏ chất trong phũng thớ nghiệm phục vụ cho việc nhuộm và làm tiờu bản: focmol, cồn, xylen. eosin,….
- Khỏng thể khỏng PRRS chế trờn thỏ hoặc chuột: Dako envision TM System Labelled Polymer (USA).
- Khỏng khỏng thể thỏ hoặc chuột: HRP anti-mouse and anti-rabbit (Dako Corporation – USA).
- Hoỏ chất sử dụng cho phản ứng RT- PCR: Kớt chiết tỏch ARN (QIAamp), Nuclease free ater, dNTP, enzym, primers, TBE, agarose…
Và cỏc dụng cụ, húa chất c n thiết khỏc phục vụ cho nghiờn cứu.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.4.1. Phương phỏp quan sỏt 2.4.1. Phương phỏp quan sỏt
Trong thực tế cỏc dịch, chỳng tụi đó tiếp cận quay phim chụp ảnh, ghi chộp và mụ tả một cỏch khỏch quan, so sỏnh và kết luận cỏc đặc điểm triệu chứng của lợn bệnh.
2.4.2. Phương phỏp mổ khỏm toàn diện
Phương phỏp này dựng để nghiờn cứu bệnh tớch của PRRS. Lợn bệnh được cố định trờn bàn m hoặc khay m . Cụng tỏc m khỏm được tiến hành theo trỡnh tự từ trờn xuống dư i, theo nguyờn tắc bộc lộ hết tất cả cỏc cơ quan để quan sỏt và tỡm ra những biến đ i về mặt bệnh tớch đại thể. Riờng nóo phải dựng cưa để cưa hộp sọ rồi bộc lộ toàn bộ hai bỏn c u và cỏc tiểu ph n của nóo để quan sỏt. Cỏc khớ quan khỏc được tiến hành rất đơn giản, m đến đõu quan sỏt đến đú. Từ hạch amidan, ph i, hạch ph i,… theo cấu tạo giải phẫu. Tất cả những biến đ i cỏc khớ quan của từng lợn bệnh, đều được ghi chộp, mụ tả và chụp ảnh để làm tư liệu nghiờn cứu.
2.4.3. Phương phỏp điều tra hồi cứu
Những lợn ốm trong vựng dịch PRRS được chọn làm thớ nghiệm, khi quan sỏt, quay phim, chụp ảnh, m khỏm,… đều được đỏnh dấu theo từng vụ dịch từng địa phương trong từng năm, sau đú lập thành hồ sơ theo dừi. Khi phõn tớch cỏc nội dung của đề tài, chỳng tụi ch truy cứu những con cú kết quả dương tớnh v i PRRS.
2.4.4. Phương phỏp lấy mẫu
- Mẫu mỏu. Mỏu lợn bệnh được lấy tại vịnh tĩnh mạch c , lợn được cố định theo tư thế nằm ngửa, kộo hai chõn trư c ra phớa sau bụng sẽ bộc lộ ph n hừm sõu phớa dư i h u và giữa hai chõn lợn, đú chớnh là vị trớ lấy mỏu. Dựng kim chọc nghiờng 4 o
từ sau ra trư c, lấy đủ lượng mỏu c n thiết bảo quản trong ống nghiệm, đỏnh dấu để phục cho cỏc xột nghiệm sinh l , sinh húa c n thiết.
- Mẫu cỏc khớ quan và t chức. Cỏc mẫu bệnh phẩm như ph i, hạch ph i, hạch ruột, gan, lỏch, thận,… được lấy những vựng cú bệnh tớch điển hỡnh nhất rồi đưa ngay về phũng thớ nghiệm để bảo quản, làm tiờu bản và cỏc xột nghiệm c n thiết.
2.4.5. Phương phỏp phõn lập virus trờn mụi trường tế bào Marc-145
PRRSV cú khả năng nhõn lờn và phỏ hủy tế bào Marc-145, sau 36, 72
giờ nuụi cấy, quan sỏt cỏc CPE (Cytopathogenic Effect) để đỏnh giỏ sự nhõn lờn của virus.
Phương phỏp phõn lập được tiến hành như sau:
+ Chu n bị tế bào: Nuụi cấy tế bào Marc-14 trong khay 96 giếng. Cho khay tế bào vào tủ ấm 370
C cú 5% CO2. Quan sỏt tế bào hàng ngày đến khi tế bào mọc thành một l p thỡ gõy nhiễm bệnh phẩm nghi cú PRRSV đó được chuẩn bị sẵn.
+ Chu n bị mẫu phõn lập
- Mẫu bệnh phẩm nghi cú PRRSV sau khi lấy được bảo quản trong tủ lạnh - 800
C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khi c n phõn lập, bệnh phẩm được đồng nhất trong mụi trường DMEM cú b sung thành ph n khỏng sinh như trờn (tỷ lệ 1:10)
- Ly tõm huyễn dịch, bỏ cặn và pha loóng theo cơ số 2 để gõy nhiễm vào mụi trường tế bào.
- Mỗi giếng gõy nhiễm 2 àl dung dịch. Mỗi mẫu bệnh phẩm gõy nhiễm trờn 3 giếng.
- Đĩa nuụi cấy được đặt trong tủ ấm 370C cú 5% CO2. - Quan sỏt CPE trờn khay nuụi cấy sau 36; 48 và 72 giờ
- Khi xuất hiện CPE (90%) thỡ thu virus, bảo quản trong tủ lạnh -800C hoặc trong Ni tơ lỏng đến khi c n sử dụng.
2.4.6. Phương phỏp RT-PCR
Để xỏc định chắc chắn lợn ốm cú mắc PRRS hay khụng. Chỳng tụi tiến hành phản ứng RT- PCR, dựng kit QIAamp để tỏch chiết ARN, v i cặp mồi ORF7;