1. .2 Khuyến cỏo cụng tỏc phũng, chống dịch PRRS tại Việt Nam
2.2.2. Nghiờn cứu đặc điểm bệnh lớ chủ yếu của lợn mắc PRRS
- Nghiờn cứu triệu chứng lõm sàng khi lợn mắc PRRS - Nghiờn cứu bệnh tớch đại thể khi lợn mắc PRRS
- Nghiờn cứu bệnh tớch vi thể của một số cơ quan khi lợn mắc PRRS - Xỏc định một số vi khuẩn kế phỏt, gõy bệnh tớch khi lợn mắc PRRS
2.2.3. Nghiờn cứu một số chỉ tiờu huyết học khi lợn mắc PRRS
+ Thay đ i về hồng c u + Thay đ i về bạch c u
+ Thay đ i về GOT, GPT của mỏu lợn ốm + Thay đ i protein huyết tương
2.2.4. Áp dụng phương phỏp húa mụ miễn dịch (IHC) để chẩn đoỏn PRRSV PRRSV
2.3. NGUYấN LIỆU 2.3.1. Dụng cụ 2.3.1. Dụng cụ
+ Mỏy quay phim, mỏy chụp ảnh để phục vụ những nghiờn cứu về triệu chứng lõm sàng và bệnh tớch đại thể.
+ Bộ đồ m : Dao m , kộo, panh, tỳi đựng mẫu bệnh phẩm, dụng cụ lấy mỏu, dụng cụ chắt huyết thanh,…
+ Mỏy PCR
+ Mỏy xử l bệnh phẩm tự động + Mỏy đỳc Block
+ Mỏy cắt tiờu bản microtom
+ Tủ ấm, tủ lạnh, mỏy làm lạnh block + Dụng cụ nhuộm và làm tiờu bản. + Kớnh hiển vi quang học.
2.3.2. Húa chất thớ nghiệm
+ Cỏc húa chất, mụi trường nuụi cấy tế bào: Mụi trường nuụi cấy DMEM, FBS, khỏng sinh, DMSO, trypsin, EDTA, PBS,…
+ Hoỏ chất trong phũng thớ nghiệm phục vụ cho việc nhuộm và làm tiờu bản: focmol, cồn, xylen. eosin,….
- Khỏng thể khỏng PRRS chế trờn thỏ hoặc chuột: Dako envision TM System Labelled Polymer (USA).
- Khỏng khỏng thể thỏ hoặc chuột: HRP anti-mouse and anti-rabbit (Dako Corporation – USA).
- Hoỏ chất sử dụng cho phản ứng RT- PCR: Kớt chiết tỏch ARN (QIAamp), Nuclease free ater, dNTP, enzym, primers, TBE, agarose…
Và cỏc dụng cụ, húa chất c n thiết khỏc phục vụ cho nghiờn cứu.
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.4.1. Phương phỏp quan sỏt 2.4.1. Phương phỏp quan sỏt
Trong thực tế cỏc dịch, chỳng tụi đó tiếp cận quay phim chụp ảnh, ghi chộp và mụ tả một cỏch khỏch quan, so sỏnh và kết luận cỏc đặc điểm triệu chứng của lợn bệnh.
2.4.2. Phương phỏp mổ khỏm toàn diện
Phương phỏp này dựng để nghiờn cứu bệnh tớch của PRRS. Lợn bệnh được cố định trờn bàn m hoặc khay m . Cụng tỏc m khỏm được tiến hành theo trỡnh tự từ trờn xuống dư i, theo nguyờn tắc bộc lộ hết tất cả cỏc cơ quan để quan sỏt và tỡm ra những biến đ i về mặt bệnh tớch đại thể. Riờng nóo phải dựng cưa để cưa hộp sọ rồi bộc lộ toàn bộ hai bỏn c u và cỏc tiểu ph n của nóo để quan sỏt. Cỏc khớ quan khỏc được tiến hành rất đơn giản, m đến đõu quan sỏt đến đú. Từ hạch amidan, ph i, hạch ph i,… theo cấu tạo giải phẫu. Tất cả những biến đ i cỏc khớ quan của từng lợn bệnh, đều được ghi chộp, mụ tả và chụp ảnh để làm tư liệu nghiờn cứu.
2.4.3. Phương phỏp điều tra hồi cứu
Những lợn ốm trong vựng dịch PRRS được chọn làm thớ nghiệm, khi quan sỏt, quay phim, chụp ảnh, m khỏm,… đều được đỏnh dấu theo từng vụ dịch từng địa phương trong từng năm, sau đú lập thành hồ sơ theo dừi. Khi phõn tớch cỏc nội dung của đề tài, chỳng tụi ch truy cứu những con cú kết quả dương tớnh v i PRRS.
2.4.4. Phương phỏp lấy mẫu
- Mẫu mỏu. Mỏu lợn bệnh được lấy tại vịnh tĩnh mạch c , lợn được cố định theo tư thế nằm ngửa, kộo hai chõn trư c ra phớa sau bụng sẽ bộc lộ ph n hừm sõu phớa dư i h u và giữa hai chõn lợn, đú chớnh là vị trớ lấy mỏu. Dựng kim chọc nghiờng 4 o
từ sau ra trư c, lấy đủ lượng mỏu c n thiết bảo quản trong ống nghiệm, đỏnh dấu để phục cho cỏc xột nghiệm sinh l , sinh húa c n thiết.
- Mẫu cỏc khớ quan và t chức. Cỏc mẫu bệnh phẩm như ph i, hạch ph i, hạch ruột, gan, lỏch, thận,… được lấy những vựng cú bệnh tớch điển hỡnh nhất rồi đưa ngay về phũng thớ nghiệm để bảo quản, làm tiờu bản và cỏc xột nghiệm c n thiết.
2.4.5. Phương phỏp phõn lập virus trờn mụi trường tế bào Marc-145
PRRSV cú khả năng nhõn lờn và phỏ hủy tế bào Marc-145, sau 36, 72
giờ nuụi cấy, quan sỏt cỏc CPE (Cytopathogenic Effect) để đỏnh giỏ sự nhõn lờn của virus.
Phương phỏp phõn lập được tiến hành như sau:
+ Chu n bị tế bào: Nuụi cấy tế bào Marc-14 trong khay 96 giếng. Cho khay tế bào vào tủ ấm 370
C cú 5% CO2. Quan sỏt tế bào hàng ngày đến khi tế bào mọc thành một l p thỡ gõy nhiễm bệnh phẩm nghi cú PRRSV đó được chuẩn bị sẵn.
+ Chu n bị mẫu phõn lập
- Mẫu bệnh phẩm nghi cú PRRSV sau khi lấy được bảo quản trong tủ lạnh - 800
C.
- Khi c n phõn lập, bệnh phẩm được đồng nhất trong mụi trường DMEM cú b sung thành ph n khỏng sinh như trờn (tỷ lệ 1:10)
- Ly tõm huyễn dịch, bỏ cặn và pha loóng theo cơ số 2 để gõy nhiễm vào mụi trường tế bào.
- Mỗi giếng gõy nhiễm 2 àl dung dịch. Mỗi mẫu bệnh phẩm gõy nhiễm trờn 3 giếng.
- Đĩa nuụi cấy được đặt trong tủ ấm 370C cú 5% CO2. - Quan sỏt CPE trờn khay nuụi cấy sau 36; 48 và 72 giờ
- Khi xuất hiện CPE (90%) thỡ thu virus, bảo quản trong tủ lạnh -800C hoặc trong Ni tơ lỏng đến khi c n sử dụng.
2.4.6. Phương phỏp RT-PCR
Để xỏc định chắc chắn lợn ốm cú mắc PRRS hay khụng. Chỳng tụi tiến hành phản ứng RT- PCR, dựng kit QIAamp để tỏch chiết ARN, v i cặp mồi ORF7;
P08L220619, P08L220620, (Mồi xuụi: GATTGCGGCAAATGATAACC; Mồi
ngược: TGCCATTCACCACACATTCT) cặp mồi này cho phộp xỏc định đoạn
gen cú kớch thư c 372bp mó húa ra protein N của virus.
Trư c tiờn c n phõn lập vius, tỏch chiết ARN làm khuụn cho quỏ trỡnh t ng hợp gen. Mẫu bệnh phẩm (2g) được nghiền nỏt bằng chày và cối vụ trựng sau đú được đồng nhất trong dung dịch DMEM (thể tớch 600àl cú b sung 10% khỏng sinh, bảo quản -80oC cho đến khi sử dụng). Mẫu đó đồng nhất được làm tan băng và ly tõm 10.000 vũng/phỳt/10 phỳt/4oC. Dịch ly tõm được gõy nhiễm vào khay 96 giếng đó được phủ một l p tế bào Marc 14 . Đặt trong tủ ấm và hàng ngày kiểm tra bệnh tớch tế bào (CPE). Những giếng tế bào cú bệnh tớch được thu và bảo quản -20oC để sử dụng cho tỏch chiết ARN của virus.
* Phương phỏp tỏch chiết ARN
Sau khi phõn lập virus trờn mụi trường tế bào c n tỏch chiết ARN của virus để tiến hành phản ứng RT- PCR.
- Quy trỡnh tỏch chiết ARN từ dịch thu tế bào gõy nhiễm virus Bư c 1: Cho 60àl Buffer AVL vào ống eppendoft
Bư c 2: Cho 140àl mẫu vào ống trờn. Votex trong 1 giõy, để nhiệt độ phũng trong 10 phỳt, ly tõm thời gian ngắn.
Bư c 3: Cho 60àl Ethanol (96% - 100%) vào ống và votex trong 1 giõy. Bư c 4: Hỳt 630àl mẫu trong ống vào cột QIA đậy nắp và ly tõm 8.000
vũng/phỳt/2 phỳt, loại bỏ dung dịch phớa dư i ống, lặp lại bư c 4 một l n nữa v i ph n mẫu cũn lại.
Bư c : Cho 00àl AW1 vào cột QIA, ly tõm 8.000 vũng/phỳt/2 phỳt, loại bỏ dịch phớa dư i cột.
Bư c 6: Cho 00àl AW2 vào cột QIA, ly tõm 13. 00 vũng/phỳt/3 phỳt, loại bỏ dịch phớa dư i cột, ly tõm lại l n nữa v i tốc độ tối đa trong 1 phỳt.
Bư c 7: Đặt cột QIA vào ống eppendoft 1. ml m i, thờm 60àl AVE để nhiệt độ phũng trong 1 phỳt, ly tõm tốc độ 8.000 vũng trong 1 phỳt. Thu dịch qua cột và bảo quản -200C hoặc -800
C.
* Phương phỏp tiến hành phản ứng RT – PCR
- Tiến hành ph n ứng RT- PCR
Mẫu ARN sau khi tỏch chiết sẽ được hỗn hợp v i cỏc thành ph n được trỡnh bày bảng 2.1. Bảng 2.1. Thành ph n phản ứng RT - PCR Thành phần ph n ứng Thể tớch cần lấy (μl) 2X Reaction Mix 12,5 Mẫu ARN 5 Primer Forwad 0,5 Primer Reverse 0,5
RT/Platium Taq Mix 0,5
Nư c cất 6
T ng thể tớch 25
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong mỏy PCR theo chu kỳ nhiệt được trỡnh bày bảng 2.2.
Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT - PCR
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ (o
C) Thời gian Chu kỳ
1 T ng hợp cADN 55 30 phỳt 1 Duỗi mạch 94 2 phỳt 2 Duỗi mạch 94 15 giõy 30 Gắn mồi 55 30 giõy T ng hợp sợi m i 72 1 phỳt 3 Hoàn ch nh 72 10 phỳt 1 4 Giữ sản phẩm 4 ∞
- Điện di kiểm tra s n ph m PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cõn 1,2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sụi trong lũ vi súng, để nguội đến khoảng 40oC, đ thạch cú số giếng tương ứng số mẫu c n điện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thờm 2 l loading dye vào 8 l sản phẩm RT-PCR - Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đó đụng vào bể điện di, thờm TBE 1X đến ngập thạch.
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR vào cỏc giếng v i thể tớch 3l maker 100bp và 10 l sản phẩm PCR mỗi giếng.
- Điện di hiệu điện thế 100V trong 30 phỳt.
- Quan sỏt kết quả điện di sản phẩm PCR trờn mỏy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
2.4.7. Phương phỏp làm tiờu bản vi thể
Phương phỏp làm tiờu bản vi thể theo quy trỡnh tẩm đỳc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE). Cỏc bư c của quỏ trỡnh làm tiờu bản vi thể như sau:
Chuẩn bị d ng và húa hất
-Dụng cụ: mỏy đỳc block, khuụn đỳc, tủ ấm, mỏy cắt mảnh mycrotom, phiến kớnh, lamen, dao, kộo, panh, kẹp, cốc đựng húa chất.
-Húa chất: focmol 10%, cồn cỏc loại, xylen paraffin, thuốc nhuộm eosin, hematoxylin.
Chuẩn bị và ố định bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm c n nghiờn cứu của lợn bệnh lấy từ cỏc vựng dịch PRRS, được cắt gọn, đỏnh dấu bằng bỳt chỡ cho từng mẫu bệnh phẩm rồi ngõm ngập vào dung dịch focmol trung tớnh 10%. Thụng thường thể tớch của focmol phải đảm bảo gấp ớt nhất 10 l n thể tớch của bệnh phẩm ngõm trong nú. Sau 10 -1 ngày lấy bệnh phẩm ra để làm cỏc bư c tiếp theo.
Vựi bệnh phẩm
Tiến hành l n lượt cỏc bư c sau:
- Cắt bệnh phẩm: lấy bệnh phẩm đó ngõm trong focmol 10%, cắt thành cỏc miếng nhỏ 3-5mm, chỳ ý cắt cỏc miếng bệnh phẩm sao cho cú hỡnh dạng g n giống v i cỏc khớ quan tự nhiờn. Vớ dụ mẫu ph i nờn cắt tạo ra khối hỡnh chúp cú cỏc mặt là tam giỏc, mẫu hạch nờn cắt tạo ra hỡnh trũn,…
- Rửa focmol: rửa dư i vũi nư c chảy nhẹ trong 24h. - Đưa mẫu vào hệ thống mỏy chuyển đỳc mẫu tự động.
Hệ thống mỏy chuyển đỳc mẫu tự động gồm 12 bỡnh
Bỡnh Húa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 600 C 1:00 2 Cồn 600 C 1:00 3 Cồn 700 C 1:30 4 Cồn 800 C 1:30 5 Cồn 960 C 1:30 6 Cồn 1000 C 1:30 7 Cồn 1000 C 1:30 8 Cồn 1000 C 1:30 9 Xylen 1:30 10 Xylen 1:30 11 Parafin 2:00 12 Parafin 2:00
Đ bl k
Đỳc mẫu bệnh phẩm trong parafin.
Cắt dỏn mảnh và ố định tiờu bản
Cắt mảnh: bằng mỏy microtom.
Tói mảnh: dàn lỏt cắt bằng phẳng trờn phiến kớnh trong nư c ấm 480
C. Sau đú để tủ ấm 370C đến khi bệnh phẩm khụ lỏt cắt bệnh phẩm gắn chặt lờn phiến kớnh thỡ ta đem nhuộm.
Nhuộm tiờu bản
Cỏc bư c tiến hành
+ Khử parafin: cho tiờu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 6h
Xylen II: 6h
Xylen III: 12h
+ Khử xylen: cho tiờu bản qua hệ thống cồn gồm 4 lọ: Cồn 1000 : 2 l n (mỗi l n 1 phỳt) Cồn 9 0 : 1 l n Cồn 700 : 1 l n Cồn 00 : 1 l n
+ Khử cồn: cho dư i vũi nư c chảy 1 phỳt. + Nhuộm haematoxylin (nhuộm nhõn)
Nhỏ hematoxilin ngập tiờu bản trong phỳt, rửa nư c. Sau đú cho tiờu bản qua hệ thống cồn:
Cồn 00: 1 l n Cồn 700: 1 l n
Cồn 9 0: 1 l n Cồn 1000: 2 l n Rửa tiờu bản
+ Nhuộm eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ eosin ngập tiờu bản khoảng -10 phỳt, rửa nư c. Cho tiờu bản qua hai lọ cồn 1000
mỗi lọ 1 phỳt.
+ Tẩy cồn, làm trong tiờu bản: cho tiờu bản đi qua xylen.
Gắn Baum anada
Nhỏ một giọt Baume canada lờn lamen rồi gắn nhanh lờn tiờu bản khi vẫn cũn xylen trờn tiờu bản, lưu khi gắn lamen sao cho khụng cũn bọt khớ trờn ph n bệnh phẩm đó nhuộm. Sau đú tiến hành đọc tiờu bản trờn kớnh hiển vi quang học.
2.4.8. Phương phỏp nhuộm húa mụ miễn dịch
Phương phỏp nhuộm hoỏ mụ miễn dịch (Immunohistochemistry -
IHC) là phương phỏp m i cú độ chớnh xỏc cao, dựng phương phỏp này
cú thể phỏt hiện được virus khỏng nguyờn tồn tại trong mụ bào. Phương phỏp nhuộm húa mụ miễn dịch được thực hiện dựa trờn nguyờn l của sự kết hợp giữa khỏng nguyờn v i khỏng thể đặc hiệu và được phỏt hiện bằng chất ch thị màu. Kết quả đỏnh giỏ mức độ nặng nhẹ khỏc nhau tựy thuộc vào sự xuất hiện cỏc điểm, cỏc đỏm màu vàng nõu trờn tiờu bản. Khi cú sự kết hợp giữa khỏng nguyờn v i khỏng thể đơn dũng đặc hiệu thỡ xuất hiện cỏc đỏm vàng nõu nghĩa là phản ứng dương tớnh hay t chức cú virus khu trỳ. Cỏc đỏm màu vàng nõu càng nhiều và càng đậm chứng tỏ virus tập trung đú càng nhiều. Phương phỏp IHC cú quy trỡnh tẩm đỳc bằng parafin giống phương phỏp làm tiờu bản vi thể (đó trỡnh bày trong ph n 2.4.7).
Sau khi cú tiờu bản bệnh phẩm, quỏ trỡnh nhuộm húa mụ miễn dịch IHC được thực hiện qua cỏc bư c sau.
* Cỏc bước nhuộm:
Bước 1: làm sạch tiờu bản
Khử parafin, khử xylen, khử cồn giống phương phỏp làm tiờu bản vi thể. Sau khi cho chảy dư i vũi nư c rửa lại tiờu bản bằng nư c cất.
Bước 2: hoạt hoỏ enzym
Ngõm ngập tiờu bản trong dung dịch PBS và hấp ư t 1210
C/5 phỳt.
Bước 3: khử peroxydase nội sinh
Dựng H2O2 trong dung mụi methanol (1H2O2 30%: 9 methanol). Ngõm tiờu bản trong 10 phỳt.
Bước 4: gắn khỏng thể (KT)
Nhỏ 80 àl KT khỏng PRRSV chuẩn/1tiờu bản. Để tủ ấm 370C/1h hoặc 40C/qua đờm.
Rửa tiờu bản bằng dung dịch PBS 3 l n ( phỳt/l n).
Bước 5: gắn khỏng khỏng thể
Nhỏ 2 giọt khỏng khỏng thể/1 tiờu bản. Để tủ ấm 370
C/1h.
Rửa PBS 3 l n ( phỳt/l n).
Bước 6: cho cơ chất
Ngõm tiờu bản trong dung dịch DAB khoảng 3-8 phỳt. Quan sỏt kết quả.
Bước 7: nhuộm nhõn tế bào bằng hematoxylin (30 giõy), làm sạch, gắn baume canada và quan sỏt bằng kớnh hiển vi quang học.
2.4.9. Phương phỏp xột nghiệm cỏc chỉ tiờu huyết học
+ Cỏc ch tiờu hồng c u, bạch c u của lợn mắc PRRS được đo bằng mỏy phõn tớch ch tiờu huyết học Celldyn 3700 của Khoa Thỳ y Trường Đại học Nụng nghiệp Hà Nội.
+ Cỏc ch tiờu GOT, GPT, được phõn tớch theo phương phỏp Bergmeyer, đo bằng mỏy phõn tớch tự động Hitachi 704 của Nhật Bản. Ch tiờu Protein huyết thanh được định lượng bằng phản ứng Biuret, đo bằng mỏy khỳc xạ kế v i bư c súng 25nm. Cỏc ch tiờu GOT, GPT và Protein huyết thanh đều được phõn tớch tại Khoa Húa sinh của bệnh viện Trung ương Quõn Đội 108.
2.4.10. Phương phỏp xột nghiệm một số vi khuẩn kế phỏt trong ổ dịch PRRS
Cỏc vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (App), Pasteurella multocida (P. multocida), Streptococcus suis (St. suis), Escherichia. coli (E. coli), Salmonella sp, Clostridium perfringens (Cl. perfringens). Được xột
nghiệm theo qui trỡnh phõn lập vi khuẩn thường qui của Bộ mụn vi trựng, Viện Thỳ y Quốc gia.
2.4.11. Phương phỏp thống kờ sinh học dựng để xử lý số liệu c n thiết
+ Do đặc trưng của đối tượng nghiờn cứu là khụng đồng nhất cho nờn số lượng mẫu phải đủ l n.
- V i số liệu định tớnh (vớ dụ như cỏc loại tỷ lệ) thỡ số mẫu nghiờn cứu n ≥ 100.
- V i số liệu định lượng (vớ dụ như số lượng hồng c u, bạch c u) thỡ số mẫu nghiờn cứu n ≥ 30.
+ Phương phỏp so sỏnh. - So sỏnh cỏc tỷ lệ.
Vớ dụ: Đối tượng nghiờn cứu 1 cứ n1 mẫu cú m1 mẫu dương tớnh, ta