với các trình tự của GenBank
Mã số
GenBank Tên chủng và gen xác định trình tự
Phần trăm trình tự đƣợc so sánh với GenBank (%) Mức độ tƣơng đồng (%)
HM017077.1 Betanodavirus NNV coat protein gene, partial cds
100 (%) 99(%)
AY510457.1 Redspotted grouper nervous necrosis virus capsid
AF283554.1 Yellow grouper nervous necrosis virus major coat
protein gene, partial cds 100 (%)
91(%)
AY284966.1 Epinephelus aeneus encephalitis virus isolate EA-
030601-IL coat protein gene, complete cds 100 (%)
91(%)
AY284963.1 Epinephelus aeneus encephalitis virus isolate EA-
040799-IL coat protein gene, complete cds 100 (%)
91(%)
AF534998.3 Epinephelus coioides nervous necrosis virus coat
protein gene, complete cds 100 (%)
91(%)
AY690596.1 Redspotted grouper nervous necrosis virus coat
protein mRNA, complete cds 100 (%)
91(%)
AF281657.1 Epinephelus tauvina nervous necrosis virus coat
protein gene, complete cds 100 (%)
91(%)
Betanodavirus NNV coat protein gene, partial cds
Sequence ID: gb|HM017077.1|Length: 421Number of Matches: 1 Related Information
Range 1: 2 to 421GenBankGraphics Next Match Previous Match First Match Alignment statistics for match #1
Score Expect Identities Gaps Strand Frame
737 bits(399) 0.0() 414/420(99%) 6/420(1%) Plus/Plus Features: Query 1 GTGTCAGTCATGTGTCGCTGGAGTGTTCGACTGAGCGTTCCGTCTCTTGAGA-ACCTGAA 59 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| Sbjct 2 GTGTCAGTCATGTGTCGCTGGAGTGTTCGACTGAGCGTTCCGTCTCTTGAGACACCTGAA 61 Query 60 GAGACCGTCGCTCCCATCATGACACAAGGTCCCCTGTACAACGATTCCCTTGCCACACAC 119 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 62 GAGACCGTCGCTCCCATCATGACACAAGGTCCCCTGTACAACGATTCCCTTGCCACACAC 121 Query 120 GACTTCAAGTCCATCCTCCTTGGATCCACACCATTGGA-ATTGCCCCTGATGGCGCAATC 178 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| Sbjct 122 GACTTCAAGTCCATCCTCCTTGGATCCACACCATTGGACATTGCCCCTGATGGCGCAATC 181
Query 179 TTCCAACTGGACCGTCCGCTGTCCATTGATTA-AGCCTTGGAACTGGAGATGTTGACCGT 237 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 182 TTCCAACTGGACCGTCCGCTGTCCATTGATTACAGCCTTGGAACTGGAGATGTTGACCGT 241 Query 238 GCTGTCTATTGGCACCTCAAGAAG-TTGCTGGAACTTCCGGCACACCTGCAGGCTGGTTT 296 |||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 242 GCTGTCTATTGGCACCTCAAGAAGTTTGCTGGAACTTCCGGCACACCTGCAGGCTGGTTT 301 Query 297 CGCTGGGGCATCTGGGAC-ATTTCAATAAAACGTTCATAGATGGCGTTGCTTACTACCCT 355 |||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 302 CGCTGGGGCATCTGGGACAATTTCAATAAAACGTTCATAGATGGCGTTGCTTACTACCCT 361 Query 356 AATCAGCAGCCTCG-CAAATCCTGCTGCCTGTCGGCACTGCCTTCACCCGTGTTGACTCG 414 |||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 362 AATCAGCAGCCTCGTCAAATCCTGCTGCCTGTCGGCACTGCCTTCACCCGTGTTGACTCG 421
Hình 3.10 So sánh độ tƣơng đồng của đoạn gen giải trình tự với đoạn gen T4 của Betanodavirus mã số HM017077.1
Từ kết quả giải trình tự gen chúng tơi kết luận rằng chủng virus phân lập đƣợc là Nervous Necrosis Virus thuộc họ Betanodavirus.
3.2. KẾT QUẢ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN CỦA NNV
3.2.1.Thiết kế vector tái tổ hợp pET32a+- T4
Trong đề tài này đã sử dụng vector pET32a+ làm vector biểu hiện gen T4. Chủng vi khuẩn E. coli JM109 đã đƣợc lựa chọn là chủng vi khuẩn kiểm tra vector tái tổ hợp, chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) đƣợc sử dụng để biểu hiện gen T4. Quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+-T4 thể hiện ở (hình 3.11).
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình tạo vector tái tổ hợp pET32a+- T4
Để tạo đƣợc vector tái tổ hợp pET32a+ mang gen T4, plasmid pGEM T - T4 đƣợc cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI để thu nhận đƣợc đoạn gen T4. Đồng thời, cắt vector pET32a+ bằng enzyme trên để tạo ra hai đầu gắn cho gen T4. Phản ứng cắt plasmid vector pGEM T- T4 và plasmid pET32a+ đƣợc thực hiện ở 370C trong thời gian 4 giờ, sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel agarose 1%. Kết quả thể hiện ở (hình 3.12).
Hình 3.12 Cắt vector pGEMT-T4(A) và vector pET32a+
(B) bằng enzyme EcoRI
Giếng 1,2,3,4(A): sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 Giếng 1,2,3(B): sản phẩm cắt plasmid pET32a+
Giếng M: Marker 1kb plus
Từ kết quả điện di trên (hình 3.12) cho thấy trên bốn giếng số 1, 2, 3 và 4(A) đều xuất hiên hai băng, một băng có kích thƣớc tƣơng đƣơng với kích thƣớc của gen T4 khoảng 420bp và một băng có kích thƣớc tƣơng đƣơng với vector pGEM-T Easy khoảng 3015bp. Trên các giếng số 1,2,3(B) đều chỉ thấy xuất hiện một băng vạch duy nhất có kích thƣớc tƣơng đƣơng vector pET 32a+ là khoảng 5900bp. Nhƣ vậy đã cắt thành công plasmid tái tổ hợp pGEMT-T4 và plasmid pET32a+ tạo ra các vị trí tƣơng thích để có thể gắn gen T4 vào vector pET32a+. Tiến hành cắt lấy băng vạch có gen T4 kích thƣớc khoảng 420bp và băng vạch có vector pET32a+ kích thƣớc 5900bp tiến hành tinh sạch. Kết quả sau khi tinh sạch đƣợc điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở (hình 3.13).
Hình 3.13. Tinh sạch sản phẩm cắt plasmid pGEMT-T4 và vector pET32a+
Giếng 1: gen T4 sau khi tinh sạch Giếng 2: plasmid pET32a+ sau tinh sạch
M: 1kb Plus Ladder
Phản ứng nối gen T4 với vector pET32a+ ở 40C, để ủ qua đêm (14-16h). Để kiểm tra sự tạo thành vector tái tổ hợp pET32a+-T4, sản phẩm nối gen đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli JM 109. Sàng lọc chủng mang vector tái tổ hợp trên mơi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh Amp(100µg/ml), ni ở điều kiện 37o
C trong thời gian 16h. Kết quả ni sau 16h thể hiện ở (hình 3.14).
Hình 3.14. Đĩa khuẩn lạc thu đƣợc sau khi chuyển gen pET32a+
-T4 vào E. coli JM109
Sau khi nuôi cấy 16h ở 370C, trên đĩa thạch xuất hiện 45 khuẩn lạc. Chọn sáu khuẩn lạc nuôi cấy trong 3ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh
Amp(100µg/ml), ni lắc với tốc độ 150 vịng/phút ở nhiệt độ 370C trong 16h. Sau đó tiến hành tách plasmid, điện di trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở (hình 3.15).
Hình 3.15. Điện di đồ kiểm tra sự tạo thành vector pET32a+
-T4 trong vi khuẩn E. coli JM109
Giếng 1÷6: Plasmid các dịng đánh số từ 1 đến 6 Giếng M: 1kb plus ladder
Tiến hành PCR với cặp mồi P1 và P2 để kiểm tra sáu mẫu plasmid mang vector tái tổ hợp pET32a+
- T4 và một mẫu vector pET32a+ làm đối chứng. Kết quả sau khi PCR kiểm tra đƣợc điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở (hình 3.16).
Hình 3.16. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong vector tái tổ hợp
Giếng 1÷6: sản phẩm PCR plasmid pET32a+-T4 các dịng đánh số từ 1 đến 6 Giếng M: 1kb Plus ladder
Từ kết quả điện di cho thấy sáu dòng vi khuẩn lựa chọn đều có mang gen T4, mẫu đối chứng không mang gen này. Kết quả này khẳng định rằng vector tái tổ hợp pET32a+- T4 đã đƣợc thiết kế thành công.
3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
3.2.2.1 Tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp pET32a+-T4 mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV
Sau khi tạo thành công vector tái tổ hợp pET32a+-T4. Lựa chọn bốn trong sáu dòng để biến nạp vào chủng biểu hiện là vi khuẩn E. coli BL21(DE3) bằng phƣơng pháp sốc nhiệt kết hợp với ion Ca2+. Vi khuẩn biến nạp đƣợc cấy trên mơi trƣờng LB thạch có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), ni ở 37oC trong thời gian 12 đến 16h. Kết quả ni sau 16h thể hiện ở (hình 3.17).
Hình 3.17. Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a+
-T4 vào E.coli BL21.
Để kiểm tra khả năng biến nạp plasmid pET32a+
-T4vào tế bào E. coli
BL21(DE3), tiến hành sàng lọc bằng cách tách plasmid và PCR kiểm tra. Sản phẩm tách plasmid đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở (hình 3.18).
Hình 3.18. Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET32a+-T4
Giếng 1÷4: Plasmid các dịng đánh số từ 1 đến 4 Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder
Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra các mẫu plasmid mang vector pET32a+- T4 với cặp mồi P1 và P2 đã đƣợc thiết kế ban đầu. Sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở hình (3.19).
Hình 3.19. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả năng biến nạp vector tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3).
Giếng 1÷4: Sản phẩm PCR plasmid các dịng đánh số từ 1 đến 4 Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder
Qua kết quả điện di cho thấy tại các giếng 1÷4 đều xuất hiện vạch có kích thƣớc tƣơng đƣơng gen với kích thƣớc của gen T4 là 420bp. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đã tạo thành công chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) mang gen mã hóa
kháng nguyên của NNV.
3.2.2.2 Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp
Nuôi tăng sinh bậc một bốn khuẩn lạc thuộc bốn dòng đã lựa chọn ở trên trong 3ml mơi trƣờng LB-Amp (100µg/ml), ni lắc ở 370C. Sau 16 giờ ni cấy, dùng pipette hút lấy 500µl dịch ni tăng sinh bậc một sang bình tam giác có chứa 50ml môi trƣờng lỏng LB-Amp (100µg/ml). Ni lắc đến khi OD600nm của dịch nuôi đạt từ 0,5-0,6 thì tiến hành bổ sung chất cảm ứng IPTG đến khi đạt nồng độ 1mM và tiếp tục nuôi lắc ở nhiệt độ 370
C với tốc độ lắc là 150 vòng/phút.
Lấy canh khuẩn vi khuẩn tái tổ hợp tại các thời điểm chƣa bổ sung IPTG, sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h để phân tích sự biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bằng SDS-PAGE. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở (hình 3.20 và 3.21).
Hình 3.20. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% các mẫu thuộc dòng số 1 và 2
Giếng1,5: protein dòng 1,2 chưa cảm ứng bởi IPTG
Giếng 2,3,4: protein dòng của dòng vi khuẩn số 1 được cảm ứng bởi IPTG 2h, 4h, 6h
Từ kết quả thể hiện trên (hình 3.20) cho thấy :
Giếng số 1,5 là protein của dòng vi khuẩn 1, 2 chƣa cảm ứng IPTG đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng không xuất hiện vạch protein lạ.
Giếng 2,3,4 là protein của dòng vi khuẩn số 1 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc là 17kDa khơng tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của protein T4 là 25kDa. Nhƣ vậy, dịng số 1 khơng biểu hiện đúng protein T4. Có thể trong q trình gắn gen T4 vào vector pET32a+ đã xảy ra hiện tƣợng gắn ngƣợc chiều promoter.
Giếng số 6,7,8 là protein của dòng vi khuẩn số 2 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc tƣơng ứng với protein T4. Nhƣ vậy dịng số 2 đã biểu hiện thành cơng gen T4.
Độ đậm của protein tăng theo thời gian nuôi cấy sau khi bổ sung IPTG. Trong đó, protein thu đƣợc khi bổ sung IPTG sau 6h nuôi cấy đậm hơn so với 4h và 2h.
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dịng số 3, 4
Giếng1,5: protein của dòng vi khuẩn số 3,4 chưa cảm ứng bởi IPTG
Giếng 2,3,4: protein của dòng vi khuẩn số 3 cảm ứng bởi IPTG trong 2h, 4h, 6h. Giếng 6,7,8: protein của dòng vi khuẩn số 4 cảm ứng bởi IPTG trong 2h, 4h, 6h. Giếng M: Broad-way Multi prestained protein Marker
Giếng số 1,5 là mẫu protein của dòng vi khuẩn số 3,4 chƣa cảm ứng IPTG không xuất hiện các vạch protein lạ.
Các giếng 2,3,4 là mẫu protein của dòng vi khuẩn số 3 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc là 25kDa tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của kháng nguyên T4.
Các giếng số 6,7,8 là mẫu protein của dòng vi khuẩn số 4 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc là 25kDa tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của kháng nguyên T4.
Độ đậm của băng protein tăng theo thời gian nuôi cấy sau khi cảm ứng bởi IPTG, protein thu đƣợc khi bổ sung IPTG sau 6h nuôi cấy đậm hơn so với 4h và 2h.
Các kết quả này cho thấy đã biểu hiện thành công gen T4 trong vi khuẩn E.
coli BL21(DE3) ở các dòng vi khuẩn BL21- pET32/T4 số 2, 3, 4; protein tái tổ hợp
có kích thƣớc là 25kDa tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của kháng nguyên T4 của NNV.
Kết quả biểu hiện protein của gen T4 mã hóa kháng nguyên của NNV đƣợc khẳng định lại bằng phƣơng pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng virus gây bệnh hoại tử thần kinh cho thấy, vị trí phản ứng giữa protein tái tổ hợp T4 với kháng thể đặc hiệu chuẩn tƣơng ứng với vị trí phản ứng giữa kháng nguyên T4 chuẩn của Pierce, Mỹ và kháng thể đặc hiệu chuẩn tại vạch điện di có kích thƣớc khoảng 25 kDa trên thang chuẩn (hình 3.22). Kết quả này cho phép kết luận rằng kháng nguyên T4 của NNV đã đƣợc biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21(DE3).
Hình 3.22. Kết quả Westen blot của protein tái tổ hợp T4
M: thang chuẩn; giếng 1: protein tái tổ hợp T4; giếng 2: protein T4 chuẩn của Pierce, Mỹ
3.2.2.3 Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp
Protein T4 tái tổ hợp có gắn với 6 histidine ở đầu N vì vậy có thể đƣợc tinh chế bằng cột sắc ký ái lực Nickel-Chelating Resin. Sinh khối vi khuẩn chủng E.coli BL21- pET32/T4 đƣợc phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm, protein tái tổ hợp ở pha hòa tan đƣợc chuyển lên cột sắc ký ái lực ProBond™ Nickel-Chelating Resin (Invitrogen). Các protein bám không đặc hiệu đƣợc loại bỏ bằng imidazole 60 mM. Ở nồng độ này, hầu hết các protein bám không đặc hiệu bị đẩy ra khỏi cột, và giữ lại protein T4. Protein này đƣợc tách ra khỏi cột bằng dung dịch thẩm tách có chứa 200 mM immidazole. Các phân đoạn protein thu đƣợc sau khi tách ra khỏi cột đƣợc kiểm tra trên gel SDS-PAGE.
Hình 3.23. Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE
M: Thang protein chuẩn, 1-5: kháng nguyên T4 thu ở pha 1, 2, 3, 4
Kết quả điện di trên (hình 3.23) cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thƣớc 25 kDa, trong đó, phân đoạn 2 thu đƣợc lƣợng protein nhiều nhất. Chứng tỏ rằng đã tinh sạch thành công protein T4.
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO KHÁNG THỂ CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
3.3.1 Kết quả đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ tái tổ hợp trên thỏ
Việc tạo thành kháng thể trung hòa là tiêu chí quan trọng để đánh giá một kháng nguyên nào đó có thể đƣợc sử dụng để sản xuất vắc xin hay không. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kích thích tạo kháng thể trung hòa trên thỏ của kháng nguyên tái tổ hợp NNV. Huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch bởi kháng nguyên sẽ đƣợc sử dụng để thực hiện các phản ứng trung hòa in vitro và in vivo.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở hệ thống in vitro
Thời gian thu huyết thanh thỏ sau khi gây
miễn dịch (ngày) Đối chứng dƣơng (CPE %) Đối chứng âm (CPE %)
Độ pha loãng huyết thanh của thỏ đƣợc gây
miễn dịch để trung hòa liều gây nhiễm
TCID50=10-4 5 98 0 ND 15 98 0 1/5 25 98 0 1/200 35 98 0 1/1600 45 98 0 1/1600 60 98 0 1/800
(ND: Not done- huyết thanh khơng trung hịa virus cường độc )
Kết quả trong (bảng 3.2) cho thấy: ở ngày thứ 5, cả lơ thỏ thí nghiệm chƣa có kháng thể trung hịa NNV cƣờng độc. Huyết thanh của thỏ đƣợc tiêm chất gây miễn dịch chứa kháng nguyên tái tổ hợp NNV có kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh NNV HP05 kể từ ngày thứ 15 sau khi gây đáp ứng miễn dịch. Ở ngày thứ 25, độ pha lỗng huyết thanh thỏ có kháng thể trung hịa là 1:200. Từ ngày thứ 35 - 45, hiệu giá trung hòa đạt giá trị cao nhất 1:1600. Hiệu giá trung hòa 1:800 cịn duy trì sau 60 ngày gây miễn dịch.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở mơ hình in vivo
Thời gian thu huyết thanh thỏ sau khi gây miễn
Đối chứng dƣơng Đối chứng âm (tỷ lệ nhiễm bệnh -
Huyết thanh của thỏ đƣợc gây miễn
dịch (ngày) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Tỷ lệ chết (%) %) Hiệu giá trung hòa Gen T4 5 100 100 0 ND + 15 100 100 0 1/50 + 25 100 100 0 1/100 - 35 100 100 0 1/100 - 45 100 100 0 1/100 - 60 100 100 0 1/50 +
(+) có gen T4, (-) khơng có gen T4
Bên cạnh việc đánh giá trung hòa virus cƣờng độc của huyết thanh đặc hiệu với NNV chúng tơi cịn thực hiện đánh giá khả năng nhiễm virus ở cá thí nghiệm. Đây là tiêu chí quan trọng, liên quan đến sự lƣu hành của mầm bệnh trong môi trƣờng nuôi cá đã sử dụng vắc xin. Cá nhiễm bệnh đƣợc xác định bằng phản ứng RT-PCR phát hiện gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu.
Kết quả trong (bảng 3.3) chỉ ra rằng: từ ngày thứ 25 - 60, sau khi gây miễn dịch, huyết thanh thỏ có khả năng trung hịa hồn tồn NNV cƣờng độc ở độ pha lỗng huyết thanh từ 1:50 - 1:100, virus khơng đƣợc phát hiện trong não của cá thí nghiệm. Tuy nhiên, tại ngày thứ 15, hiệu giá trung hòa của huyết thanh thỏ đạt 1:50, tồn bộ lơ cá thí nghiệm khơng có cá thể chết nhƣng gen mã hóa kháng nguyên đặc