Hình 3 .12 Cắt vector pGEMT-T4(A) và vector pET32a+ (B) bằng enzyme EcoRI
Hình 3.16 Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt gen T4 trong vector tái tổ hợp
Giếng 1÷6: sản phẩm PCR plasmid pET32a+-T4 các dịng đánh số từ 1 đến 6 Giếng M: 1kb Plus ladder
Từ kết quả điện di cho thấy sáu dòng vi khuẩn lựa chọn đều có mang gen T4, mẫu đối chứng không mang gen này. Kết quả này khẳng định rằng vector tái tổ hợp pET32a+- T4 đã đƣợc thiết kế thành công.
3.2.2. Biểu hiện gen T4 trong vi khuẩn E. coli BL21(DE3)
3.2.2.1 Tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp pET32a+-T4 mang gen mã hóa kháng nguyên của NNV
Sau khi tạo thành công vector tái tổ hợp pET32a+-T4. Lựa chọn bốn trong sáu dòng để biến nạp vào chủng biểu hiện là vi khuẩn E. coli BL21(DE3) bằng phƣơng pháp sốc nhiệt kết hợp với ion Ca2+. Vi khuẩn biến nạp đƣợc cấy trên mơi trƣờng LB thạch có bổ sung kháng sinh Ampicillin (100µg/ml), ni ở 37oC trong thời gian 12 đến 16h. Kết quả ni sau 16h thể hiện ở (hình 3.17).
Hình 3.17. Đĩa khuẩn lạc sau khi biến nạp pET32a+
-T4 vào E.coli BL21.
Để kiểm tra khả năng biến nạp plasmid pET32a+
-T4vào tế bào E. coli
BL21(DE3), tiến hành sàng lọc bằng cách tách plasmid và PCR kiểm tra. Sản phẩm tách plasmid đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở (hình 3.18).
Hình 3.18. Điện di đồ plasmid tái tổ hợp tách từ chủng E. coli BL21(DE3) mang vector pET32a+-T4
Giếng 1÷4: Plasmid các dịng đánh số từ 1 đến 4 Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder
Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra các mẫu plasmid mang vector pET32a+- T4 với cặp mồi P1 và P2 đã đƣợc thiết kế ban đầu. Sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thể hiện ở hình (3.19).
Hình 3.19. Điện di đồ sản phẩm PCR kiểm tra khả năng biến nạp vector tái tổ hợp pET32a+ -T4 vào chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3).
Giếng 1÷4: Sản phẩm PCR plasmid các dịng đánh số từ 1 đến 4 Giếng M: GeneRulerTM 1kb DNA Ladder
Qua kết quả điện di cho thấy tại các giếng 1÷4 đều xuất hiện vạch có kích thƣớc tƣơng đƣơng gen với kích thƣớc của gen T4 là 420bp. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đã tạo thành công chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) mang gen mã hóa
kháng nguyên của NNV.
3.2.2.2 Biểu hiện gen T4 trong tế bào vi khuẩn tái tổ hợp
Nuôi tăng sinh bậc một bốn khuẩn lạc thuộc bốn dòng đã lựa chọn ở trên trong 3ml mơi trƣờng LB-Amp (100µg/ml), ni lắc ở 370C. Sau 16 giờ ni cấy, dùng pipette hút lấy 500µl dịch ni tăng sinh bậc một sang bình tam giác có chứa 50ml môi trƣờng lỏng LB-Amp (100µg/ml). Ni lắc đến khi OD600nm của dịch nuôi đạt từ 0,5-0,6 thì tiến hành bổ sung chất cảm ứng IPTG đến khi đạt nồng độ 1mM và tiếp tục nuôi lắc ở nhiệt độ 370
C với tốc độ lắc là 150 vòng/phút.
Lấy canh khuẩn vi khuẩn tái tổ hợp tại các thời điểm chƣa bổ sung IPTG, sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h để phân tích sự biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bằng SDS-PAGE. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở (hình 3.20 và 3.21).
Hình 3.20. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% các mẫu thuộc dòng số 1 và 2
Giếng1,5: protein dòng 1,2 chưa cảm ứng bởi IPTG
Giếng 2,3,4: protein dòng của dòng vi khuẩn số 1 được cảm ứng bởi IPTG 2h, 4h, 6h
Từ kết quả thể hiện trên (hình 3.20) cho thấy :
Giếng số 1,5 là protein của dòng vi khuẩn 1, 2 chƣa cảm ứng IPTG đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng không xuất hiện vạch protein lạ.
Giếng 2,3,4 là protein của dòng vi khuẩn số 1 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc là 17kDa khơng tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của protein T4 là 25kDa. Nhƣ vậy, dịng số 1 khơng biểu hiện đúng protein T4. Có thể trong q trình gắn gen T4 vào vector pET32a+ đã xảy ra hiện tƣợng gắn ngƣợc chiều promoter.
Giếng số 6,7,8 là protein của dòng vi khuẩn số 2 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc tƣơng ứng với protein T4. Nhƣ vậy dịng số 2 đã biểu hiện thành cơng gen T4.
Độ đậm của protein tăng theo thời gian nuôi cấy sau khi bổ sung IPTG. Trong đó, protein thu đƣợc khi bổ sung IPTG sau 6h nuôi cấy đậm hơn so với 4h và 2h.
Hình 3.21. Điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 15% dịng số 3, 4
Giếng1,5: protein của dòng vi khuẩn số 3,4 chưa cảm ứng bởi IPTG
Giếng 2,3,4: protein của dòng vi khuẩn số 3 cảm ứng bởi IPTG trong 2h, 4h, 6h. Giếng 6,7,8: protein của dòng vi khuẩn số 4 cảm ứng bởi IPTG trong 2h, 4h, 6h. Giếng M: Broad-way Multi prestained protein Marker
Giếng số 1,5 là mẫu protein của dòng vi khuẩn số 3,4 chƣa cảm ứng IPTG không xuất hiện các vạch protein lạ.
Các giếng 2,3,4 là mẫu protein của dòng vi khuẩn số 3 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc là 25kDa tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của kháng nguyên T4.
Các giếng số 6,7,8 là mẫu protein của dòng vi khuẩn số 4 đƣợc cảm ứng bởi IPTG trong 2h,4h,6h xuất hiện một băng vạch protein đậm có kích thƣớc là 25kDa tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của kháng nguyên T4.
Độ đậm của băng protein tăng theo thời gian nuôi cấy sau khi cảm ứng bởi IPTG, protein thu đƣợc khi bổ sung IPTG sau 6h nuôi cấy đậm hơn so với 4h và 2h.
Các kết quả này cho thấy đã biểu hiện thành công gen T4 trong vi khuẩn E.
coli BL21(DE3) ở các dòng vi khuẩn BL21- pET32/T4 số 2, 3, 4; protein tái tổ hợp
có kích thƣớc là 25kDa tƣơng ứng với kích thƣớc lý thuyết của kháng nguyên T4 của NNV.
Kết quả biểu hiện protein của gen T4 mã hóa kháng nguyên của NNV đƣợc khẳng định lại bằng phƣơng pháp lai Western blot với kháng thể đặc hiệu kháng virus gây bệnh hoại tử thần kinh cho thấy, vị trí phản ứng giữa protein tái tổ hợp T4 với kháng thể đặc hiệu chuẩn tƣơng ứng với vị trí phản ứng giữa kháng nguyên T4 chuẩn của Pierce, Mỹ và kháng thể đặc hiệu chuẩn tại vạch điện di có kích thƣớc khoảng 25 kDa trên thang chuẩn (hình 3.22). Kết quả này cho phép kết luận rằng kháng nguyên T4 của NNV đã đƣợc biểu hiện thành công trong tế bào E. coli BL21(DE3).
Hình 3.22. Kết quả Westen blot của protein tái tổ hợp T4
M: thang chuẩn; giếng 1: protein tái tổ hợp T4; giếng 2: protein T4 chuẩn của Pierce, Mỹ
3.2.2.3 Tinh sạch kháng nguyên tái tổ hợp
Protein T4 tái tổ hợp có gắn với 6 histidine ở đầu N vì vậy có thể đƣợc tinh chế bằng cột sắc ký ái lực Nickel-Chelating Resin. Sinh khối vi khuẩn chủng E.coli BL21- pET32/T4 đƣợc phá vỡ tế bào bằng sóng siêu âm, protein tái tổ hợp ở pha hòa tan đƣợc chuyển lên cột sắc ký ái lực ProBond™ Nickel-Chelating Resin (Invitrogen). Các protein bám không đặc hiệu đƣợc loại bỏ bằng imidazole 60 mM. Ở nồng độ này, hầu hết các protein bám không đặc hiệu bị đẩy ra khỏi cột, và giữ lại protein T4. Protein này đƣợc tách ra khỏi cột bằng dung dịch thẩm tách có chứa 200 mM immidazole. Các phân đoạn protein thu đƣợc sau khi tách ra khỏi cột đƣợc kiểm tra trên gel SDS-PAGE.
Hình 3.23. Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE
M: Thang protein chuẩn, 1-5: kháng nguyên T4 thu ở pha 1, 2, 3, 4
Kết quả điện di trên (hình 3.23) cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thƣớc 25 kDa, trong đó, phân đoạn 2 thu đƣợc lƣợng protein nhiều nhất. Chứng tỏ rằng đã tinh sạch thành công protein T4.
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO KHÁNG THỂ CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
3.3.1 Kết quả đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ tái tổ hợp trên thỏ
Việc tạo thành kháng thể trung hòa là tiêu chí quan trọng để đánh giá một kháng nguyên nào đó có thể đƣợc sử dụng để sản xuất vắc xin hay không. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kích thích tạo kháng thể trung hòa trên thỏ của kháng nguyên tái tổ hợp NNV. Huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch bởi kháng nguyên sẽ đƣợc sử dụng để thực hiện các phản ứng trung hòa in vitro và in vivo.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở hệ thống in vitro
Thời gian thu huyết thanh thỏ sau khi gây
miễn dịch (ngày) Đối chứng dƣơng (CPE %) Đối chứng âm (CPE %)
Độ pha loãng huyết thanh của thỏ đƣợc gây
miễn dịch để trung hòa liều gây nhiễm
TCID50=10-4 5 98 0 ND 15 98 0 1/5 25 98 0 1/200 35 98 0 1/1600 45 98 0 1/1600 60 98 0 1/800
(ND: Not done- huyết thanh khơng trung hịa virus cường độc )
Kết quả trong (bảng 3.2) cho thấy: ở ngày thứ 5, cả lơ thỏ thí nghiệm chƣa có kháng thể trung hịa NNV cƣờng độc. Huyết thanh của thỏ đƣợc tiêm chất gây miễn dịch chứa kháng nguyên tái tổ hợp NNV có kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh NNV HP05 kể từ ngày thứ 15 sau khi gây đáp ứng miễn dịch. Ở ngày thứ 25, độ pha lỗng huyết thanh thỏ có kháng thể trung hịa là 1:200. Từ ngày thứ 35 - 45, hiệu giá trung hòa đạt giá trị cao nhất 1:1600. Hiệu giá trung hòa 1:800 cịn duy trì sau 60 ngày gây miễn dịch.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở mơ hình in vivo
Thời gian thu huyết thanh thỏ sau khi gây miễn
Đối chứng dƣơng Đối chứng âm (tỷ lệ nhiễm bệnh -
Huyết thanh của thỏ đƣợc gây miễn
dịch (ngày) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Tỷ lệ chết (%) %) Hiệu giá trung hòa Gen T4 5 100 100 0 ND + 15 100 100 0 1/50 + 25 100 100 0 1/100 - 35 100 100 0 1/100 - 45 100 100 0 1/100 - 60 100 100 0 1/50 +
(+) có gen T4, (-) khơng có gen T4
Bên cạnh việc đánh giá trung hòa virus cƣờng độc của huyết thanh đặc hiệu với NNV chúng tơi cịn thực hiện đánh giá khả năng nhiễm virus ở cá thí nghiệm. Đây là tiêu chí quan trọng, liên quan đến sự lƣu hành của mầm bệnh trong môi trƣờng nuôi cá đã sử dụng vắc xin. Cá nhiễm bệnh đƣợc xác định bằng phản ứng RT-PCR phát hiện gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu.
Kết quả trong (bảng 3.3) chỉ ra rằng: từ ngày thứ 25 - 60, sau khi gây miễn dịch, huyết thanh thỏ có khả năng trung hịa hồn tồn NNV cƣờng độc ở độ pha lỗng huyết thanh từ 1:50 - 1:100, virus khơng đƣợc phát hiện trong não của cá thí nghiệm. Tuy nhiên, tại ngày thứ 15, hiệu giá trung hòa của huyết thanh thỏ đạt 1:50, tồn bộ lơ cá thí nghiệm khơng có cá thể chết nhƣng gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu vẫn đƣợc phát hiện khi kiểm tra ngẫu nhiên các mẫu cá trong lô.
Từ các kết quả trong nghiên cứu này và kết quả thể hiện trong (hình 3.10) cho phép kết luận rằng kháng nguyên tái tổ hợp NNV có hoạt tính kháng ngun, đồng thời, kháng ngun này có khả năng tạo kháng thể đặc hiệu để trung hòa virus cƣờng độc gây bệnh hoại tử thần kinh.
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú tổ hợp trên cá mú
Kháng nguyên tái tổ hợp NNV có bản chất kháng nguyên của NNV khi đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hịa trên thỏ. Tuy nhiên, kháng ngun này có thể sử dụng để sản xuất vắc xin hay khơng thì cần thực hiện đánh giá trực tiếp trên cá mú. Kết quả đƣợc trình bày trong (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả xác định hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus
gây bệnh hoại tử thần kinh tạo đƣợc trên cá mú bằng phƣơng pháp in vitro
Mẫu thí nghiệm
Độ pha loãng dịch chiết của cá đƣợc gây miễn dịch để trung hòa TCID50 =10-4
15 ngày 30 Ngày 45 ngày 60 ngày 75 Ngày 90 ngày Đối chứng dƣơng + + + + + +
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với E.coli BL21- pET32/T4 - - - - - -
Dịch chiết cá gây miễn dịch với E.coli BL21- pET32/T4 + NNV cƣờng độc
1:64 1:256 1:128 1:128 1:64 1:8
(-): âm tính, (+): dương tính
Khả năng tạo đáp ứng miễn dịch ở cá mú đƣợc duy trì cho đến ngày thứ 90. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trên cá nói chung. Các nghiên cứu đó cho rằng việc tạo đáp ứng miễn dịch trên cá sau khi tiếp xúc với tác nhân gây bệnh thƣờng kéo dài vài tháng nếu khơng có sự tiếp xúc lặp lại sau đó (Eldar và cộng sự, 1997). Độ pha loãng dịch chiết cá mú đƣợc gây miễn dịch với kháng nguyên tái tổ hợp NNV cho kháng thể trung hòa virus NNV cƣờng độc cao nhất
ở ngày thứ 30 - 60, đạt 1:128 - 1:256. Sự hình thành kháng thể trung hịa ở cá mú bột đối với bệnh hoại tử thần kinh cho đến ngày thứ 90 là cơ sở để triển khai sản xuất vắc xin phịng bệnh bởi vì virus gây bệnh chỉ tấn cơng và gây thất thốt cá ở giai đoạn cá bột và ấu trùng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1. Đã tách dịng thành cơng và xác định đƣợc trình tự gen T4 mã hóa cho kháng nguyên bề mặt của virus gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú. Trình tự gen này có độ tƣơng đồng đạt 99% so với các trình tự của Genbank.
2. Đã biểu hiện thành cơng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV trong hệ biểu hiện pET-32a(+), E.coli BL21. Chủng vi khuẩn biểu hiện E.coli BL21- pET32/T4 đƣợc phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu với NNV tại thành phần protein có kích thƣớc 25 kDa.
3. Chủng vi khuẩn E.coli BL21-pET32/T4 biểu hiện gen mã hóa kháng
nguyên bề mặt của NNV có khả năng tạo kháng thể trung hịa đặc hiệu trên thỏ và cá mú.
2. Kiến nghị
- Tối ƣu hóa các điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ IPTG để thu đƣợc lƣợng protein tối đa.
- Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện sản phẩm vắc xin nhằm phục vụ sản xuất đƣợc vắc xin phịng bệnh cho cá mú ni cơng nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2012), Thông tư ban hành Danh mục
các bệnh thủy sản phải công bố dịch, Hà Nội, tháng 8 năm 2012.
2. Nguyễn Ngọc Du, Lê Hữu Tài, Cao Thành Trung, Phạm Võ Ngọc Ánh, Trƣơng Hồng Việt (2005), “Bệnh thƣờng gặp trên cá mú nuôi tại Vũng Tàu”,
Hội thảo quốc gia về Phát triển thủy sản vùng hạ lưu sông Mekong, Bộ Thủy
sản, 01, 529-534.
3. Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Ngọc Du (2008), Bài giảng Tổng quan về các bệnh
nguy hiểm thường gặp trên động vật nuôi biển, Viện nghiên cứu nuôi trồng
thủy sản II, TP. Hồ Chí Minh.
4. Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên (2008), “Bệnh tử hoại thần kinh trên cá biển ni tại Khánh Hịa”, Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy Sản, 01, 19-24. 5. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Thu Hiền, Vũ Tiến Lâm, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam”, Khoa học kỹ thuật thú y, 19 (6), 76-79.
6. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
7. Nguyễn Thi Vui (2012), Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus
gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú, Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp,
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. Arimoto M., Mushiake K., Mizuta Y., Nakai T., Muroga K., Furusawa I. (1992), “Detection of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) by enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA)”, Fish Pathol, 27, pp. 191-195.
9. Arimoto M., Sato J., Maruyama K., Mimura G. and Furusawa (1996), “Effect