Hình 3 .12 Cắt vector pGEMT-T4(A) và vector pET32a+ (B) bằng enzyme EcoRI
Hình 3.23 Điện di protein T4 tinh sạch trên gel SDS-PAGE
M: Thang protein chuẩn, 1-5: kháng nguyên T4 thu ở pha 1, 2, 3, 4
Kết quả điện di trên (hình 3.23) cho thấy, tất cả các phân đoạn dịch tinh sạch đều chỉ xuất hiện duy nhất một băng protein ở kích thƣớc 25 kDa, trong đó, phân đoạn 2 thu đƣợc lƣợng protein nhiều nhất. Chứng tỏ rằng đã tinh sạch thành công protein T4.
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TẠO KHÁNG THỂ CỦA KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP NGUYÊN TÁI TỔ HỢP
3.3.1 Kết quả đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa của kháng nguyên tái tổ hợp trên thỏ tái tổ hợp trên thỏ
Việc tạo thành kháng thể trung hòa là tiêu chí quan trọng để đánh giá một kháng nguyên nào đó có thể đƣợc sử dụng để sản xuất vắc xin hay không. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kích thích tạo kháng thể trung hòa trên thỏ của kháng nguyên tái tổ hợp NNV. Huyết thanh thỏ sau khi gây miễn dịch bởi kháng nguyên sẽ đƣợc sử dụng để thực hiện các phản ứng trung hòa in vitro và in vivo.
Bảng 3.2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở hệ thống in vitro
Thời gian thu huyết thanh thỏ sau khi gây
miễn dịch (ngày) Đối chứng dƣơng (CPE %) Đối chứng âm (CPE %)
Độ pha loãng huyết thanh của thỏ đƣợc gây
miễn dịch để trung hòa liều gây nhiễm
TCID50=10-4 5 98 0 ND 15 98 0 1/5 25 98 0 1/200 35 98 0 1/1600 45 98 0 1/1600 60 98 0 1/800
(ND: Not done- huyết thanh khơng trung hịa virus cường độc )
Kết quả trong (bảng 3.2) cho thấy: ở ngày thứ 5, cả lơ thỏ thí nghiệm chƣa có kháng thể trung hịa NNV cƣờng độc. Huyết thanh của thỏ đƣợc tiêm chất gây miễn dịch chứa kháng ngun tái tổ hợp NNV có kháng thể trung hịa virus gây bệnh hoại tử thần kinh NNV HP05 kể từ ngày thứ 15 sau khi gây đáp ứng miễn dịch. Ở ngày thứ 25, độ pha lỗng huyết thanh thỏ có kháng thể trung hịa là 1:200. Từ ngày thứ 35 - 45, hiệu giá trung hòa đạt giá trị cao nhất 1:1600. Hiệu giá trung hòa 1:800 cịn duy trì sau 60 ngày gây miễn dịch.
Bảng 3.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở mơ hình in vivo
Thời gian thu huyết thanh thỏ sau khi gây miễn
Đối chứng dƣơng Đối chứng âm (tỷ lệ nhiễm bệnh -
Huyết thanh của thỏ đƣợc gây miễn
dịch (ngày) Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) Tỷ lệ chết (%) %) Hiệu giá trung hòa Gen T4 5 100 100 0 ND + 15 100 100 0 1/50 + 25 100 100 0 1/100 - 35 100 100 0 1/100 - 45 100 100 0 1/100 - 60 100 100 0 1/50 +
(+) có gen T4, (-) khơng có gen T4
Bên cạnh việc đánh giá trung hòa virus cƣờng độc của huyết thanh đặc hiệu với NNV chúng tơi cịn thực hiện đánh giá khả năng nhiễm virus ở cá thí nghiệm. Đây là tiêu chí quan trọng, liên quan đến sự lƣu hành của mầm bệnh trong môi trƣờng nuôi cá đã sử dụng vắc xin. Cá nhiễm bệnh đƣợc xác định bằng phản ứng RT-PCR phát hiện gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu.
Kết quả trong (bảng 3.3) chỉ ra rằng: từ ngày thứ 25 - 60, sau khi gây miễn dịch, huyết thanh thỏ có khả năng trung hịa hồn tồn NNV cƣờng độc ở độ pha lỗng huyết thanh từ 1:50 - 1:100, virus khơng đƣợc phát hiện trong não của cá thí nghiệm. Tuy nhiên, tại ngày thứ 15, hiệu giá trung hòa của huyết thanh thỏ đạt 1:50, tồn bộ lơ cá thí nghiệm khơng có cá thể chết nhƣng gen mã hóa kháng nguyên đặc hiệu vẫn đƣợc phát hiện khi kiểm tra ngẫu nhiên các mẫu cá trong lô.
Từ các kết quả trong nghiên cứu này và kết quả thể hiện trong (hình 3.10) cho phép kết luận rằng kháng nguyên tái tổ hợp NNV có hoạt tính kháng ngun, đồng thời, kháng ngun này có khả năng tạo kháng thể đặc hiệu để trung hòa virus cƣờng độc gây bệnh hoại tử thần kinh.
3.3.2. Kết quả đánh giá khả năng sinh đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên tái tổ hợp trên cá mú tổ hợp trên cá mú
Kháng nguyên tái tổ hợp NNV có bản chất kháng nguyên của NNV khi đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hịa trên thỏ. Tuy nhiên, kháng ngun này có thể sử dụng để sản xuất vắc xin hay khơng thì cần thực hiện đánh giá trực tiếp trên cá mú. Kết quả đƣợc trình bày trong (bảng 3.4).
Bảng 3.4. Kết quả xác định hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus
gây bệnh hoại tử thần kinh tạo đƣợc trên cá mú bằng phƣơng pháp in vitro
Mẫu thí nghiệm
Độ pha loãng dịch chiết của cá đƣợc gây miễn dịch để trung hòa TCID50 =10-4
15 ngày 30 Ngày 45 ngày 60 ngày 75 Ngày 90 ngày Đối chứng dƣơng + + + + + +
Dịch chiết cá gây miễn dịch
với E.coli BL21- pET32/T4 - - - - - -
Dịch chiết cá gây miễn dịch với E.coli BL21- pET32/T4 + NNV cƣờng độc
1:64 1:256 1:128 1:128 1:64 1:8
(-): âm tính, (+): dương tính
Khả năng tạo đáp ứng miễn dịch ở cá mú đƣợc duy trì cho đến ngày thứ 90. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trên cá nói chung. Các nghiên cứu đó cho rằng việc tạo đáp ứng miễn dịch trên cá sau khi tiếp xúc với tác nhân gây bệnh thƣờng kéo dài vài tháng nếu khơng có sự tiếp xúc lặp lại sau đó (Eldar và cộng sự, 1997). Độ pha loãng dịch chiết cá mú đƣợc gây miễn dịch với kháng nguyên tái tổ hợp NNV cho kháng thể trung hòa virus NNV cƣờng độc cao nhất
ở ngày thứ 30 - 60, đạt 1:128 - 1:256. Sự hình thành kháng thể trung hịa ở cá mú bột đối với bệnh hoại tử thần kinh cho đến ngày thứ 90 là cơ sở để triển khai sản xuất vắc xin phịng bệnh bởi vì virus gây bệnh chỉ tấn cơng và gây thất thốt cá ở giai đoạn cá bột và ấu trùng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
1. Đã tách dịng thành cơng và xác định đƣợc trình tự gen T4 mã hóa cho kháng nguyên bề mặt của virus gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú. Trình tự gen này có độ tƣơng đồng đạt 99% so với các trình tự của Genbank.
2. Đã biểu hiện thành cơng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV trong hệ biểu hiện pET-32a(+), E.coli BL21. Chủng vi khuẩn biểu hiện E.coli BL21- pET32/T4 đƣợc phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu với NNV tại thành phần protein có kích thƣớc 25 kDa.
3. Chủng vi khuẩn E.coli BL21-pET32/T4 biểu hiện gen mã hóa kháng
nguyên bề mặt của NNV có khả năng tạo kháng thể trung hịa đặc hiệu trên thỏ và cá mú.
2. Kiến nghị
- Tối ƣu hóa các điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH, nồng độ IPTG để thu đƣợc lƣợng protein tối đa.
- Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện sản phẩm vắc xin nhằm phục vụ sản xuất đƣợc vắc xin phịng bệnh cho cá mú ni cơng nghiệp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2012), Thông tư ban hành Danh mục
các bệnh thủy sản phải công bố dịch, Hà Nội, tháng 8 năm 2012.
2. Nguyễn Ngọc Du, Lê Hữu Tài, Cao Thành Trung, Phạm Võ Ngọc Ánh, Trƣơng Hồng Việt (2005), “Bệnh thƣờng gặp trên cá mú nuôi tại Vũng Tàu”,
Hội thảo quốc gia về Phát triển thủy sản vùng hạ lưu sông Mekong, Bộ Thủy
sản, 01, 529-534.
3. Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Ngọc Du (2008), Bài giảng Tổng quan về các bệnh
nguy hiểm thường gặp trên động vật nuôi biển, Viện nghiên cứu nuôi trồng
thủy sản II, TP. Hồ Chí Minh.
4. Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên (2008), “Bệnh tử hoại thần kinh trên cá biển ni tại Khánh Hịa”, Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy Sản, 01, 19-24. 5. Phạm Thị Tâm, Phạm Công Hoạt, Nguyễn Thị Thu Hiền, Vũ Tiến Lâm, Nguyễn Thị Vui, Nguyễn Thị Thanh (2012), “Nghiên cứu khả năng gây bệnh và gây đáp ứng miễn dịch của virut gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú nuôi ở Việt Nam”, Khoa học kỹ thuật thú y, 19 (6), 76-79.
6. Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen nguyên lý và ứng dụng, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
7. Nguyễn Thi Vui (2012), Phân lập và xác định một số đặc điểm sinh học của virus
gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú, Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp,
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
8. Arimoto M., Mushiake K., Mizuta Y., Nakai T., Muroga K., Furusawa I. (1992), “Detection of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) by enzyme- linked immunosorbent assay (ELISA)”, Fish Pathol, 27, pp. 191-195.
9. Arimoto M., Sato J., Maruyama K., Mimura G. and Furusawa (1996), “Effect of chemical and physical treatments on the inactivation of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV)”, Aquaculture, 143, pp. 15-22.
10. Azad I.S., Shekar M.S., Thirunavukkarasu A.R., Poornima M., Kailasan M., Rajan J.S., Ali S.A., Abraham M., Ravichandran P. (2005), “Nodavirus infection causes mortalities in hatchery produced larvae of Lates calcarifer. First report from India”, Dis Aquat Organ, 63, pp. 113-118.
11. Azad I.S., Shekhar M.S., Thirunavukkarasu A.R., Jithendran K.P. (2006), “Viral nerve necrosis in hatchery-produced fry of Asian seabass Lates calcarifer:
sequential microscopic analysis of histopathology”, Dis Aquat Organ, 73, pp.
123-130.
12. Baeck G.W., Gomez D.K., Oh K.S., Kim J.H., Choresca C.H., Park S.C. (2007), “Detection of piscine nodaviruses from apparently healthy wild marine fish in Korea”, Bull Eur Assoc Fish Pathol, 27, pp. 116-122.
13. Barke D.E., MacKinnon A.M., Boston L., Burt M.D., Cone D.K., Speare D.J., Griffiths S., Cook M., Ritchie R., Olivier G. (2002), “First report of piscine nodavirus infecting wild winter flounder Pleuronectes americanus in
Passamaquoddy Bay, New Brunswick”, Canada Dis Aquat Organ, 49, pp. 99-105. 14. Bloch B., Gravningen K. & Larsen J. L. (1991), “Encephalomyelitis among
turbot associated with picoARNvirus-like agent”, Diseases of Aquatic Organisms, 10, pp. 126-139.
15. Breuil G., Bonami J.R., Pepin J.F., and Pichot Y. (1991), “Viral infection (picoARN-like virus) associated with mass mortalities in hatchery-reared sea-bass (Dicentrarchus labrax) larvae and juveniles”, Aquaculture, 97, pp. 109-116.
16. Cherif N., Gagne N., Groman D., Kibenge F., Iwamoto T., Yason C., Hammami S. (2010), “Complete sequencing of Tunisian redspotted grouper nervous necrosis virus betanodavirus capsid gene and ARN-dependent ARN polymerase gene”, J Fish Dis, 33, pp. 231-240.
17. Chi S.C., Lo C.F., Kou G.H., Chang P.S., Peng S.E., Chen S.N. (1997), “Mass mortalities associated with viral nervous necrosis (VNN) disease in two species of hatchery-reared grouper, Epinephelus fuscogutatus and Epinephelus
akaara (Temminck & Schlegel)”, J Fish Dis, 20, pp. 185-193.
18. Chi S.C., Shieh J.R., Lin S.J. (2003), “Genetic and antigenic analysis of betanodavirus isolated from aquatic organisms in Taiwan”, Dis Aquat Organ, 55, pp. 221-228.
19. Chi S.C., Wu Y.C., Cheng T.M. (2005), “Persistent infection of betanodavirus in a novel cell line derived from the brain tissue of barramundi Lates calcarifer”, Dis Aquat Organ, 65, pp. 91-98.
20. Chua F.H.C., Loo J.J., Wee J.Y. (1995), “Mass mortality in juvenile greasy grouper, Epinephelus tauvina, associated with vacuolating encephalopathy and retinopathy”, Dis Asian Aquac, 11, pp. 235-241.
21. Comps M., Trindade M., Delsert C.L. (1996), “Investigation of encephalitis viruses (FEV) expression in marine fishes using DIG-labelled probes”,
Aquaculture, 143, pp. 113-121.
22. Crane M., Hyatt A. (2011), “Review Viruses of fish: an overview of significant pathogens”, ViruseS, 3(11), pp. 2025-46.
23. Danayadol Y., Direkbusarakom S., Supamattaya K. (1995), “Viral nervous necrosis in brownspotted grouper”, Epinephelus malabaricus.
24. Delsert C., Morin N. & Comps M. (1997), “Fish nodavirus lytic cycle and semipermissive expression in mammalian and ®sh cell culture”, JouARNl of Virology, 71, pp. 5673-5677.
25. Fenner B.J., Thiagarajan R., Chua H.K., Kwang J. (2006), “Betanodavirus B2 is a ARN interference antagonist that facilitates intracellular viral ARN accumulation”, J Virol, 80, pp. 85-94.
26. Frerichs G.N., Rodger H.D. & Peric Z. (1996), “Cell culture isolation of piscine neuropathy nodavirus from juvenile sea bass, Dicentrarchus labrax”, J
Gen Virol, 77, pp. 2067-2071.
27. Frerchs G.N., Tweedie A., Starkey W.G. and Richards R.H. (2000), “Temperature, pH and electrolyte sensitivity and heat, UV and disinfectant inactivation of sea bass (Dicentrarchus labrax) neuropathy nodavirus”,
Aquaculture, 185, pp. 12-24.
28. Glazebrook J.S., Heasman M.P. and de Beer S.W. (1990), “PicoARN-like viral particles associated with mass mortalities in larval barramundi, Lates calcarifer Bloch”, JouARNl of Fish Diseases, 13, pp. 245-249.
29. Grotmol S., Bergh O., Totland G.K. (1999), “Transmission of viral encephalopathy and retinopathy (VER) to yolk-sac larvae of the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus: occurrence of nodavirus in various organs and a possible route of infection”, Dis Aquat Organ, 36, pp. 95-106.
30. Grotmol S., Nerland A.H., Beering E., Totland G.K., Nishizawa T. (2000), “Characterisation of the capsid protein gene from a nodavirus strain affecting the Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus and design of an optimal RT–
31. Husgar S., Grotmol S., Hjeltnes B.K., Rodseth O.M., Biering E. (2001), “Immune response to a recombinant capsid protein of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) in turbot Scophthalmus maximus and Atlantic halibut Hippoglossus hippoglossus, and
evaluation of a vaccine against SJNNV”, Dis Aquat Organ, 45, pp. 33-44.
32. Iwamoto T., Mise K., Takeda A., Okinaka Y., Mori K.I., Arimoto M., Nakai T. (2005), “Characterization of striped jack nervous necrosis virus sub genomic ARN3 and biological activities of its encoded protein B2”, J Gen Virol, 6, pp. 2807-2816.
33. Johansen R., Sommerset I., Tørud B., Korsnes K., Hjortaas M.J., Nilsen F., Nerland A.H., Dannevig B.H. (2004), “Characterization of nodavirus and viral encephalopathy and retinopathy in farmed turbot, Scophthalmus maximus”, J Fish Dis, 27, pp. 591-601.
34. Johnson S.C., Sperker S.A., Leggiadro C.T., Groman D.B., Griffiths S.G., Ritchie R.J., Cook M.D., Cusack R.R. (2002), “Identification and characterization of a piscine neuropathy and nodavirus from juvenile Atlantic cod from the Atlantic coast of North America”, J Aquat Anim Health, 14, pp. 124-133.
35. Lai Y.S., Chiu H.C., Murali S., Guo I.C., Chen S.C., Fang K. & Chan C.Y. (2001a), “In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper, Epinephelus awoara (Temmink & Schlegel)”, J. Fish Dis, 24, pp. 237-244.
36. Liu H., Teng Y., Zheng X., Wu Y., Xie X., He J., Ye Y., Wu Z. (2012), “Complete sequence of a viral nervous necrosis virus (NNV) isolated from red-spotted grouper (Epinephelus akaara) in China”, Arch Virol, 157, pp.
37. Maltese C. and Bovo G. (2001), “Effects of some chemico-phisical treatments on the virus causing the Viral Encephalo-Retinopathy in farmed sea bass (Dicentrarchus labrax)”, Bol Soc It Patol Ittica, 31, pp. 3-16.
38. Manin B.O., Ransangan J. (2011), “Experimental evidence of horizontal transmission of betanodavirus in hatchery-produced Asian seabass, Lates calcarifer and brown-marbled grouper, Epinephelus fuscoguttatus fingerling”, Aquaculture, 321, pp. 157-165.
39. Mezeth K.B., Patel S., Henriksen H., Szilvay A.M., Nerland A.H. (2009), “B2 protein from betanodavirus is expressed in recently infected but not in chronically infected fish”, Dis Aquat Organ, 83, pp. 97-103.
40. Mladineo I. (2003), “The immunohistochemical study of nodavirus changes in larva, juvenile and adult sea bass tissue”, J. Appl. Ichthyol, 19, pp. 366-370. 41. Mori K.I., Nakai T.., Muroga K., Arimoto M., Mushiake K. and Furusawa I.
(1992), “Properties of a new virus belonging to nodaviridae found in larval striped jack (Pseudocaranx dentex) with nervous necrosis”, Virology, 187, pp. 368-371
42. Munday B.L., Kwang J., Moody N. (2002), “Betanodavirus infections of teleost fish: a review”, J Fish Dis, 25, pp. 127-142.
43. Munday B.L., Langdon J.S., Hyatt A. & Humpphrey J.D. (1992), “Mass mortality associated with a viral-induced vacuolating encephalopathy and retinopathy of larval and juvenile barramundi”, Lates calcarifer (Bloch), Aquaculture, 103, pp. 197-211.
44. Nakai T., Mori K., Nishizawa T., Muroga K. (1995), “Viral nervous necrosis of larval and juvenile marine fish. In: Proceedings of the ARN intetional symposium on biotechnology applications in aquaculture”, Asian Fisheries Society, 10, pp. 147-52.
45. Nakai T., Mori K., Sugaya T., Nishioka T., Mushiake K., Yamashita H. (2009), “Current knowledge on viral nervous necrosis (VNN) and its causative betanodaviruses”, Isr J Aquacult-Bamid, 61, pp. 198-207.
46. Nguyen H.D., Nakai T., Muroga K. (1996), “Progression of striped jack nervous necrosis virus (SJNNV) infection in naturally and experimentally infected striped jack Pseudocaranxdentex larvae”, Dis Aquat Organ, 24, pp. 99-105.
47. Nishizawa T., Mori K., Furuhashi M., Nakai T., Furusawa I., Muroga K. (1995), “Comparison of the coat protein genes of five fish nodaviruses, the causative agents of viral nervous necrosis in marine fish”, J Gen Virol, 76, pp. 1563-1569.
48. Nishizawa T., Furuhashi M., Nagai T., Nakai T., Muroga K.(1997), “Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene”, Appl Environ Microbiol, 63, pp. 1633-1636.
49. Panzarin V., Fusaro A., Monne I., Cappellozza E., Patarnello P., Bovo G., Capua I., Holmes E.C., Cattoli G. (2012), “Molecular epidemiology and evolutionary dynamics of betanodavirus in southern Europe”, Infect Genet
Evol, 12(1), pp. 63-70.
50. Peducasse S., Castric J., Thiery R., Jeffroy J., Le Ven A. & Baudin Laurencin F.