Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Ligase buffer T4 DNA pGEM - T T4 ligase H2O 10X 10 µg/ µl 10 µg/ µl 5 u/ µ l - 1 2 1 1 5 Tổng thể tích 10
Thực hiện phản ứng trong tube đã thanh trùng, ủ tube ở 16oC trong 14 giờ, sau đó bảo quản ở 4oC, ln thực hiện phản ứng trên đá.
2.2.1.6. Chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
( Sambroook. J, Russel. DW, 2001)[51]
a) Chuẩn bị tế bào khả biến
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo tế bào khả biến đối với E.coli JM109, thực hiện nhƣ sau:
+ Tăng sinh cấp một:
- Lấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 3ml môi trƣờng LB lỏng đƣợc chứa trong ống fancol 15ml. Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 370
C, lắc 200 vòng/phút, thời gian 12- 16 giờ.
+ Tăng sinh cấp hai:
- Cấy chuyền 500µl dịch nuôi cấy trên vào 50ml môi trƣờng LB lỏng trong bình tam giác 250ml đã bổ sung kháng sinh thích hợp.
- Ni cấy lắc 200 vịng/phút, 370C cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0,6 – 0,8.
+ Tạo tế bào khả biến:
- Chuyển dịch nuôi cấy vào ống fancol 50ml. Ngâm trong nƣớc đá 5-10 phút.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Bỏ dịch. - Hòa tan sinh khối tế bào trong 10-15ml nƣớc cất khử trùng đã đƣợc để lạnh. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Bỏ dịch.
- Hòa tan sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1M 15% glycerol lạnh. Ngâm trong nƣớc đá 5 phút và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Bỏ dịch.
Hòa tan sinh khối trong 1ml dung dịch CaCl2 0,1M 15% glycerol. Ngâm trong nƣớc đá 30 phút.
b) Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
- Đặt ống eppendorf chứa tế bào khả biến vào nƣớc đá ngay sau khi lấy ra
khỏi tủ lạnh.
- Bổ sung 2 - 5µl DNA plasmid vào, trộn đều. Giữ trong nƣớc đá 30 phút. - Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 420C trong 60 giây.
- Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào nƣớc đá để 1-2 phút.
- Cho vào 500 µl mơi trƣờng LB lỏng. Ni cấy lắc ở 370C, 200 vịng/phút trong 1 giờ.
c) Chọn lọc tế bào mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp sàng lọc xanh - trắng.
Cấy trang 100μl hỗn hợp biến nạp trên mơi trƣờng LB rắn có bổ sung Ampicilin (100mg/ml), X-gal (40mg/ml), IPTG (100mM). Nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm.
2.2.1.7. Tách plasmid từ vi khuẩn E.coli
( Sambroook. J, Russel. DW, 2001)[51]
Tiến hành.
- Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli mang DNA plasmid cần tách chiết trong 3ml môi trƣờng LB lỏng chứa trong ống fancol 15ml có bổ sung kháng sinh thích hợp. Ni ở tủ ấm 370C, lắc 200 vòng/phút, thời gian từ 12-16 giờ đến khi OD600 đạt 1-2.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 6000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, 40C. Bỏ dịch nuôi.
- Cho 300µl Solution I, vortex cho tế bào tan đều.
- Bổ sung 400µl Solution II, lắc nhẹ nhàng trộn đều dung dịch để thành tế bào tan hết, đến khi dung dịch có màu trong suốt.
- Bổ sung 300µl Solution III, lắc nhẹ nhàng tới khi xuất hiện kết tủa trắng. - Ly tâm ở 40C, 6000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipette hút dịch chuyển sang ống eppendorf 2ml đáy vuông sạch, bỏ phần kết tủa.
- Bổ sung 600µl resin, lắc đều.
- Chạy cột binding column, lắp vào máy hút chân không, rửa cột hai lần bằng nƣớc cất đã thanh trùng, mỗi lần dùng 1ml.
- Chuyển dung dịch vào cột, đợi cho dịch chảy hết qua cột thì tiến hành rửa cột. - Rửa cột hai lần bằng cồn 700 để lạnh. Mỗi lần dùng 1ml cồn.
- Đem cột ly tâm ở 40
C, 10.000 vòng/phút, trong 10 phút để loại cồn. - Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 20µl dung dịch đệm TE, để 1 phút. - Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút ở 40
C. - Thu dịch chứa DNA, chạy điện di kiểm tra.
2.2.1.8. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR và enzyme giới hạn
a) Phản ứng PCR master mix Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Master mix 2X - 12,5 H2O - 4.5 P1 10 µM 0,5 P2 10 µM 0,5 DNA plasmid 10 µg/µl 2 Tổng thể tích 20
Chu trình nhiệt Biến tính: 95ºC/ 5phút - 94ºC/ 30 giây - 60ºC/30 giây 30 chu kỳ - 72ºC/ 30 giây Kết thúc: 72º C/ 5 phút
Giữ sản phẩm PCR ở 4oC, chạy điện di để kiểm tra
b) Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn
- Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI
Phản ứng cắt bằng EcoRI để kiểm tra sự có mặt của T4
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng xử lý pGEM - T/T4 bằng enzyme giới hạn
EcoRI
Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
H2O
Đệm cho EcoRI hoạt động
EcoRI DNA plasmid - 10X 10 u/µl 10 µg/µl 3 1 1 5 Tổng thể tích 10
Ủ ở 37oC trong vòng 2,5- 3h. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả.
2.2.1.9. Tinh sạch DNA từ gel agarose
Tiến hành:
- Mẫu gel agarose có chứa băng DNA quan tâm đƣợc cắt ra và cho vào ống eppendorf 2 ml đáy vuông sạch.
- Bổ sung 600µl Guanidine thiocynate 6M, lắc đều, làm nóng ở 600C để hịa tan hồn tồn.
- Tiếp đó thêm 600µl dung dịch resin, lắc đều và đƣa vào chạy cột binding column với máy hút chân không.
- Cột đƣợc rửa hai lần, mỗi lần sử dụng 1 ml cồn lạnh 700, sau đó đem cột ly tâm 10.000 vòng/phút, ở 40C trong 10 phút.
- Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 20µl TE buffer, để 1-2 phút rồi đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dung dịch chứa DNA đã tinh sạch.
2.2.1.10. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
Xác định trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trình đƣợc thực hiện theo Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing
2.2.2. Phƣơng pháp biểu hiện
Hình 2.4. Quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV
2.2.2.1. Thiết kế vector biểu hiện pET-32a(+)/T4
Vector biểu hiện tái tổ hợp đƣợc thiết kế bằng cách cài gắn đoạn gen T4 vào plasmid pET-32a(+) sau khi cả hai thành phần này cùng đƣợc xử lý bởi enzyme giới
Sản phẩm tách dòng gen T4 đƣợc tinh sạch
và xác định trình tự
Vector pET- 32a(+) đƣợc cắt bằng
EcoRI
Nối T4 vào pET-32a(+) tạo vector tái tổ hợp
Chuyển vector tái tổ hợp vào
E.coli BL21
Kiểm tra bằng điện di
SDS-PAGE
Kiểm tra bằng Western blot
hạn EcoRI. Phản ứng ghép nối đoạn gen T4 vào vector pET-32a(+) đƣợc thực hiện trong hỗn hợp với các thành phần đƣợc trình bày ở (bảng 2.7).
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 vào pET-32a(+) Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) ligase buffer T4 ADN pET-32a(+) T4 ligase H2O 10X 10 µg/ µl 10 µg/ µl 5 u/ µl - 1 2 1 1 5 Tổng thể tích 10
Phản ứng ghép nối đƣợc thực hiện trong 2 giờ ở nhiệt độ 22oC. Sau khi kết thúc, hỗn hợp đƣợc dùng để biến nạp vào E.coli BL21(DE3).
2.2.2.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp trong tế bào E.coli BL2(DE3)
Sau khi plasmid tái tổ hợp mang gen T4 đƣợc biến nạp thành công vào tế bào biểu hiện E.coli BL21(DE3), protein tái tổ hợp đƣợc tiến hành biểu hiện theo các bƣớc:
- Nuôi tăng sinh một khuẩn lạc E. coli BL21 có chứa vector pET32a+-T4 (vector pET32a+ có chứa gene T4) trong ống fancol chứa 3 ml mơi trƣờng LB-Amp (100µg/ml) lỏng ở 370
C với tốc độ lắc 150 vòng/phút, để qua đêm (14-16h).
- Chuyển 800 µl dịch ni từ ống fancol sang bình tam giác có chứa 50 ml mơi trƣờng LB-Amp (100µg/ml) lỏng, tiếp tục nuôi ở 370
C với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong khoảng từ 1-2h.
- Khi OD600 = 0,6-0,8. Lấy 1,3 ml dịch nuôi cho vào ống effendof mới để làm mẫu chuẩn. Sau đó bổ sung IPTG cho tới khi nồng độ đạt 1mM vào dịch nuôi, tiếp tục nuôi lắc ở 300C, trong 6h tiếp theo.
- Tại các thời điểm sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h. Lấy 1,3 ml dịch nuôi cho vào ống effendorf mới để thu protein.
- Ly tâm thu tế bào. Bổ sung từ 50-60µl dung dịch Sample buffer. Vortex để hịa tan tế bào. Ngâm trong nƣớc sơi từ 10-15p.
- Sản phẩm biểu hiện sẽ đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sử dụng cột ái lực Ni2+.
2.2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
Quy trình tinh sạch bao gồm các bƣớc:
1. Ly tâm 400 ml dịch tế bào đã kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp
với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút rồi tiến hành thu cặn.
2. Thêm 15 ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer), ủ trong đá 5 phút.
3. Tiến hành ly tâm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 30 giây/lần, nghỉ 30 giây trong 20 phút.
4. Chia nhỏ dung dịch ra các ống eppendorf 2 ml, tiến hành ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút rồi thu dịch.
5. Phần dịch nổi chứa protein tái tổ hợp đƣợc đƣa lên cột Nickel - Chelating Resin đã chuẩn bị truớc. Đảo đều trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Cố định cột theo chiều thẳng đứng cho dịch chảy ra từ từ.
6. Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Binding Buffer (8 M Urea; 20 mM Sodium phosphate pH = 7,8; NaCl 500 mM).
7. Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Wash Buffer (8 M Urea; Sodium phosphate 20 mM pH = 6; NaCl 500 mM).
8. Rửa cột 4 lần bằng 8 ml Native Wash Buffer (Native Purification Buffer và Imidazole pH = 6).
9. Thu protein tái tổ hợp bằng 6 ml Native Elution Buffer, thu 5 phân đoạn mỗi phân đoạn 1 ml.
Sản phẩm tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide.
2.2.2.4. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS - PAGE)
a) Nguyên tắc
Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE còn đƣợc gọi là phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide không liên tục và mẫu protein đã đƣợc biến tính bằng tác nhân biến tính. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng.
b) Quy trình
Pha gel polyacrylamide.
Pha gel cơ với nồng độ 15%.
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Fancol 50ml sạch : 0,5ml H20 cất hai lần; 1,9 ml Tris– HCl 1M pH 8,8; 2,5ml Acrylamide; 50µl 10% SDS; 50µl 10% Amonium persulfate; 2µl TEMED.
Pha gel tách nồng độ 5%
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Fancol 50 ml khác: 1,38ml H2O; 250µl Tris– HCl 0,5 M pH 6,8; 330µl Acrylamide; 20µl SDS 10%, 20µl Amonium persulfate 10%; 2µl TEMED.
Tiến hành điện di và xem kết quả
- Dùng pipette hút lấy 20µl dung dịch protein đã đƣợc biến tính và 10µl Marker Protein chuẩn nạp mẫu vào các giếng sao cho mẫu khơng bì tràn ra khỏi giếng.
- Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 65V, cƣờng độ dòng điện là 400mA trong thời gian 30 phút để mẫu chạy hết bản gel phía trên. Sau đó, chạy điện di ở hiệu điện thế 110V trong thời gian 120 phút. Chú ý quan sát chạy điện di cho tới khi vạch màu của dịch nạp mẫu cách đáy gel khoảng 0,5 – 1cm thì dừng lại tránh hiện tƣợng mẫu chạy vƣợt ra khỏi bản gel.
- Tháo gel ra khỏi khay, nhuộm gel bằng dung dịch Staining buffer. Đặt trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong thời gian 120 phút để bản gel đƣợc nhuộm đều màu.
- Sau khi nhuộm xong, rửa gel với nƣớc 5 phút. Tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm Destaining buffer. Lắc trên máy lắc ở nhiệt độ phòng cho đến khi nền gel trở nên trong suốt không màu. Sau khi giải nhuộm xong, protein đƣợc phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
2.2.2.5. Phản ứng Western blot
Một đặc tính bắt buộc của kháng ngun đó là phải đƣợc nhận biết bởi kháng thể đặc hiệu. Vi khuẩn E.coli BL21- pET32/T4 biểu hiện thành công protein T4
nhƣng protein này có thể hiện tính đặc hiệu của NNV hay không, chúng tôi tiến hành thực hiện kiểm tra bằng Western blot, đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Bước 1: Sau khi chạy điện di gel SDS-PAGE, ủ gel trong transfer buffer
trong 10 phút.
Cắt các mảnh giấy lọc và màng PVDF theo kích thƣớc bản gel. Ủ các mảnh giấy lọc và miếng xốp trong đệm chuyển trong 10 phút. Ủ màng PVDF trong methanol trong 1 phút.
- Bước 2: Xếp xen kẽ bản gel và màng PVDF giữa xốp và giấy theo thứ tự (cao su/ giấy/ gel/ màng/giấy/ cao su) và kẹp chặt lại cùng với nhau đảm bảo khơng có bọt khí lọt vào giữa gel và màng.
- Bước 3: Chuyển protein từ gel SDS-PAGE lên màng PVDF bằng dòng điện 200 mA, ở 4oC trong 2 giờ. Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 5 phút với TBS. Cố định với BSA 3% trong 2 giờ.
- Bước 4: Ủ màng với T4 Antibody trong BSA 3% ở 4oC, qua đêm. Rửa màng PVDF 3 lần, mỗi lần khoảng 10 phút với TBST.
- Bước 5: Ủ màng với HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG trong BSA 3% trong 2h. Rửa màng PVDF 3 lần mỗi lần rửa khoảng 10 phút với TBST.
2.2.3. Phƣơng pháp đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp
2.2.3.1. Đánh giá khả năng tạo kháng thể trung hòa
2.2.3.1.1. Phản ứng ELISA a) Nguyên tắc
Phƣơng pháp ELISA dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất
Tiêm thỏ
Bổ sung nhũ dầu MONTANIDE
E. coli BL21/NNV
Tiêm cá
Đánh giá khả năng tạo đáp ứng trung hòa NNV in vitro và in vivo Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên trên cá bằng phƣơng pháp in vitro 1 2
Lên men có bổ sung IPTG
thích hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu.
b) Quy trình
1. Phủ kháng nguyên: kháng nguyên đã đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1/100, 1/200, 1/300… vào mỗi giếng đĩa Elisa 96 giếng, ủ qua đêm ở 4o
C.
2. Loại bỏ kháng nguyên, bổ sung vào mỗi giếng 100 µl dịch sữa gầy 0,5%, ủ 2 giờ ở 37oC.
3. Loại bỏ sữa gầy, rửa giếng bằng PBS-Tween 20 (0,05%), ngâm giếng 1 phút với PBS-Tween 20 trƣớc khi vẩy sạch, thực hiện ba lần liên tục.
4. Bổ sung 50 µl kháng thể vào mỗi giếng (kháng thể đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1/100, 1/200, 1/300…).
5. Loại bỏ kháng thể , rửa lại các giếng bằng PBS- Tween 20 (0,05%) thực hiện rửa 3 lần liên tục. Bổ sung 100 µl IgG (đã đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1/8000) vào mỗi giếng, ủ ở 370C trong 45 phút.
6. Bổ sung 50 µl substrate vào mỗi giếng, để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. 7. Dừng phản ứng bằng H2SO4 1M.
8. Chụp ảnh, tiến hành đọc kết quả ELISA bằng máy đọc kết quả tự động.
2.2.3.1.2. Phản ứng trung hòa in vitro
a) Nguyên tắc
Thỏ đƣợc gây miễn dịch với kháng ngun NNV có hình thành kháng thể đặc hiệu với virus gây bệnh hoại tử thần kinh. Kháng thể này có thể nhận biết và trung hòa virus cƣờng độc. Mức độ trung hòa virus đƣợc đánh giá trên tế bào lách cá GS01 (là tế bào mẫn cảm với NNV).
- Huyết thanh thỏ đƣợc gây miễn dịch với kháng nguyên tái tổ hợp NNV đƣợc pha loãng theo hệ số 10 với các tỷ lệ 1:10, 1:100, 1:1000.
- Ủ huyết thanh với virus NNV cƣờng độc chủng HP05 với liều TCID50 =10-4 trong 37oC, qua đêm.
- 20 μl dịch trung hòa đƣợc gây nhiễm trở lại trên tế bào GS01 để đánh giá khả năng trung hòa của kháng thể (xác định bằng mức độ hủy hoại tế bào).