Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ TÁCH DỊNG GEN MÃ HĨA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA
3.1.1. Kết quả tách chiết RNA tổng số
Chúng tôi đã tiến hành thu thập 11 mẫu cá mú giống nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh ở Cát Bà - Hải Phịng với các triệu chứng điển hình nhƣ: thân đen xám, đặc biệt đi và các vây chuyển màu đen (hình 3.1b), mắt đục, hoặc bóng hơi phồng (hình 3.1c). Cá bệnh hoạt động yếu, bơi khơng định hƣớng (bơi quay trịn hoặc xốy trôn ốc), kém ăn hoặc bỏ ăn, đầu treo trên mặt nƣớc hoặc nằm dƣới đáy bể hay đáy lồng (hình 3.1a).
Hình 3.1. Biểu hiện của cá mú khi mắc bệnh hoại tử thần kinh
Từ các mẫu cá nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh, não và mắt cá đƣợc thu và tách
đến HP11. Kết quả tách RNA tổng số đƣợc kiểm tra và đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% (hình 3.2).
Hình 3.2. Kết quả điện di RNA tổng số
Giếng 1- 11: các mẫu từ HP1 đến HP11 Giếng 12: marker
Kết quả điện di trên gel agarose 1% cho thấy, RNA tổng số của 10 mẫu đã tách chiết đạt yêu cầu, riêng mẫu HP8 có hiện tƣợng đứt gãy RNA, vì vậy chúng tơi đã loại trừ mẫu này, 10 mẫu cịn lại đƣợc sử dụng làm khn để khuếch đại gen T4 mục tiêu nhằm kiểm tra sự có mặt của T4 trong các mẫu cá nghi mắc VNN.
3.1.2. Kết quả RT-PCR
Dựa trên trình tự gen T4, chúng tôi đã thiết kế đƣợc cặp mồi khuếch đại có trình tự:
P1 (5’- CCGGAATTCGTGTCAGTCATGTGTCGCTG-3’) và P2 (3’- CCGCTCGAGCGAGTCAACACGGGTGAAG-5’)
Kết quả phản ứng RT-PCR với các mẫu RNA tổng số ký hiệu từ HP1 - HP7 và HP9 - HP11 đƣợc thể hiện ở (hình 3.3).
Hình 3.3. Kết quả RT-PCR của 10 mẫu RNA tổng số
Giếng 1÷10: các mẫu lần lượt HP1, HP2, HP3, HP4, HP5, HP6, HP7, HP9, HP10, HP11. Giếng 12: 1kb Plus Ladder
Kết quả điện di đồ cho thấy: các mẫu HP2, HP3, HP5, HP6, HP7, HP9, HP10, HP11 xuất hiện băng có kích thƣớc 420bp tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn gen T4. Các mẫu HP1, HP4 không thấy xuất hiện băng tƣơng ứng với kích thƣớc gen này. Từ kết quả của phản ứng RT-PCR, bƣớc đầu chúng tôi kết luận: 8/11 mẫu cá mú có các biểu hiện lâm sàng của bệnh hoại tử thần kinh đã nhiễm NNV.
Với sản phẩm phản ứng RT-PCR đạt yêu cầu, các mẫu HP5, HP6, HP7, HP9, HP10, HP11 đƣợc sử dụng để tiến hành tinh sạch DNA bằng phƣơng pháp tinh sạch không dùng gel agarose. Sản phẩm tinh sạch đƣợc điện di trên gel agarose 1% (hình 3.4)
Hình 3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm RT-PCR
Giếng từ 1-6: HP5, HP6, HP7, HP9, HP10, HP11 Giếng 7: 1kb Plus Ladder
Sau khi tinh sạch chỉ có mẫu HP05 ở giếng số 1 là đạt yêu cầu, xuất hiện 1 băng rõ, tƣơng ứng với vạch có kích thƣớc 420bp của gen T4. Các mẫu HP06, HP07, HP10, sau khi tinh sạch chúng tơi khơng nhìn thấy sản phẩm DNA, có thể do nồng độ DNA sau tinh sạch quá thấp hoặc do kỹ thuật thao tác đã làm mất đi DNA, mẫu HP09 ở giếng số 4 xuất hiện 2 vạch có thể do DNA bị đứt gãy hoặc do phản ứng PCR không đặc hiệu, mẫu HP11 ở giếng số 6 cũng có thể do DNA bị đứt gãy.
DNA đƣợc tinh sạch từ sản phẩm RT-PCR của mẫu HP05 đƣợc sử dụng để tách dòng và xác định trình tự.