Chƣơng 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp tách dịng
Hình 2.1. Quy trình tách dịng gen T4
2.2.1.1. Tách chiết RNA tổng số
( Theo quy trình của Kit RNeasy Qiagen của hãng Qiagen, Mỹ)
Các bước tiến hành
Cho 250µl dịch mẫu đã qua xử lý + 100µl RNase-free water + 350µl RLT buffer(chứa guanidine thiocyanate) vào ống eppendorf 1,5ml, vortex trong 5 phút.
B sung 250àl ethanol (96ữ100%), mix nh bng pipette
Hút 700µl sang cột tách silicagel, đậy nắp, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 4˚C, thu cột rồi đổ dịch nổi.
Bổ sung 500µl dung dịch RPE pha lỗng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cột tách, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 15 giây ở 4 ºC (rửa cột để loại bỏ tạp chất), thu cột rồi đổ dịch nổi.
Thu mẫu cá nghi mắc bệnh Tách chiết RNA tổng số RT-PCR Tinh sạch sản phẩm RT-PCR
Tạo plasmid tái tổ hợp
Chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
Chọn lọc các tế bào mang plasmid tái tổ hợp Tách plasmid tái tổ hợp Kiểm tra bằng PCR Kiểm tra bằng enzyme giới hạn Giải trình tự gen
Bổ sung 500µl RPE pha lỗng với ethanol (tỉ lệ 1:4) vào cột tách , ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút ở 4˚C. Thu cột bỏ tube ở dƣới.
Chuyển cô ̣t sang tu be mới , ly tâm 12.000 vòng/phút trong 1 phút, thu cô ̣t tách và bỏ tube.
Chuyển cô ̣t sang eppendorf 1,5ml có nắp . Bở sung 30µl RNase -free water, đóng nắp ly tâm 10.000 vòng/phút trong 1 phút, thu đƣợc RNA tinh sạch.
Điện di kiểm tra trên gel agarose 1% để kiểm tra RNA tổng số.
2.2.1.2. Điện di axit nucleic trên gel agarose
( Sambroook. J, Russel. DW, 2001)[51]
Cân 0,3g agarose cho vào 30ml TAE 1X ở nhiệt độ phịng, khuấy đều và cho vào lị vi sóng 3 phút để làm nóng chảy gel.
Làm nguội gel xuống 50 – 55oC, thêm 3µl ethidium bromide, lắc đều rồi đổ vào khuôn gel đã lắp lƣợc, để thạch dày khoảng 0,75 – 1 cm, đặt khuôn gel vào bể điện di và đổ đệm TAE 1X vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5mm.
Lấy 2µl dung dịch nạp mẫu (loading buffer) cho mỗi mẫu cần điện di, lấy mẫu cần điện di (thể tích tùy thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, lấy toàn bộ dung dịch vừa trộn nạp vào giếng.
Đậy nắp bể điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 85 – 100 V, thời gian 30 phút.
Sau khi điện di xong, soi gel dƣới ánh sáng UV để xem kết quả.
2.2.1.3. Phản ứng RT - PCR
(Thực hiện theo kít RT-PCR one step của hãng Qiagen, Mỹ)
Để khuếch đại trình tự T4 của RNA-2 dài 421 bp của E. fuscogutatus và E.akaara, dựa trên trình tự của GenBank chúng tôi đã thiết kế cặp mồi gồm:
P1 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) và P2 (3’-AGAAGTGGGCACAACTGAGC-5’)
Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (µl) RT-PCR buffer Q- solution dNTP Enzyme DNA-polymerase Mồi: - P1 (10µM) - P2 (10µM) RNA temperlate RNase- free water
5 5 1 1 0,5 0,5 1 6 Tổng 20 Chu trình nhiệt RT: 50ºC/ 30phút PCR: Biến tính 95ºC/ 15phút - 94ºC/ 30 giây - 60ºC/30 giây 30 chu kỳ - 72ºC/ 1 phút Kết thúc 72º C/ 5p
Kết quả RT-PCR sẽ đƣợc điện di để so sánh với các mẫu chuẩn và kết luận.
2.2.1.4. Phản ứng PCR
(Theo Kary Mullis và các cộng sự, 1985, Mỹ)
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
DNA khn Mồi: - P1 (10 µM) - P2 (10 µM)
2X Master mix (QUIAGEN) H2O 1 1 1 10 7 Tổng 20 Chu trình nhiệt Biến tính: 95ºC/ 5phút - 94ºC/ 30 giây - 60ºC/30 giây 30 chu kỳ - 72ºC/ 30 giây
Kết thúc: 72º C/ 5 phút
Giữ sản phẩm PCR ở 4oC, chạy điện di để kiểm tra.
2.2.1.5. Tinh sạch DNA không sử dụng gel agarose
Tiến hành tinh sạch sản phẩm theo các bƣớc sau:
Trộn đều hỗn hợp gồm: sản phẩm sau phản ứng RT-PCR, sodium acetate 3M (một lƣợng bằng 1/5 so với lƣợng sản phẩm RT-PCR), isopropanol (một lƣợng bằng 80 - 100% so với lƣợng sản phẩm RT-PCR). Đặt tube chứa hỗn hợp trên ở -20oC trong 25 phút. Sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 30 phút.
Dùng pipette hút bỏ dịch nổi, thu cặn. Chú ý hút thật cẩn thận vì cặn là sản phẩm RT-PCR đã kết tủa, có thể rất ít và khó nhìn thấy.
Rửa với ethanol 70%, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, bỏ dịch thu cặn. Khi cồn khơ hết thì hịa sản phẩm vào 50 µl H2O, bảo quản ở -20oC.
2.2.1.6. Tạo plasmid tái tổ hợp mang gen T4
a) Xử lý gen T4 bằng enzyme giới hạn
Phản ứng cắt gen T4 đƣợc thực hiện với enzyme EcoRI.
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt gen T4 Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Nƣớc khử ion Đệm cho enzyme Enzyme EcoRI T4 DNA - 10X 10 u/ µl 1 µg/ µl 7,6 1 0,4 1 Tổng thể tích 10
b) Ghép nối gen T4 và pGEM - T
Hỗn hợp phản ứng ghép nối bao gồm các thành phần đƣợc trình bày trong (bảng 2.4).
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 và pGEM - T Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Ligase buffer T4 DNA pGEM - T T4 ligase H2O 10X 10 µg/ µl 10 µg/ µl 5 u/ µ l - 1 2 1 1 5 Tổng thể tích 10
Thực hiện phản ứng trong tube đã thanh trùng, ủ tube ở 16oC trong 14 giờ, sau đó bảo quản ở 4oC, ln thực hiện phản ứng trên đá.
2.2.1.6. Chuyển plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến
( Sambroook. J, Russel. DW, 2001)[51]
a) Chuẩn bị tế bào khả biến
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo tế bào khả biến đối với E.coli JM109, thực hiện nhƣ sau:
+ Tăng sinh cấp một:
- Lấy 1 khuẩn lạc E. coli vào 3ml môi trƣờng LB lỏng đƣợc chứa trong ống fancol 15ml. Nuôi cấy ở điều kiện nhiệt độ 370
C, lắc 200 vòng/phút, thời gian 12- 16 giờ.
+ Tăng sinh cấp hai:
- Cấy chuyền 500µl dịch nuôi cấy trên vào 50ml môi trƣờng LB lỏng trong bình tam giác 250ml đã bổ sung kháng sinh thích hợp.
- Ni cấy lắc 200 vịng/phút, 370C cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy đạt khoảng 0,6 – 0,8.
+ Tạo tế bào khả biến:
- Chuyển dịch nuôi cấy vào ống fancol 50ml. Ngâm trong nƣớc đá 5-10 phút.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Bỏ dịch. - Hòa tan sinh khối tế bào trong 10-15ml nƣớc cất khử trùng đã đƣợc để lạnh. Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Bỏ dịch.
- Hòa tan sinh khối tế bào trong 10ml dung dịch CaCl2 0,1M 15% glycerol lạnh. Ngâm trong nƣớc đá 5 phút và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, 40C. Bỏ dịch.
Hòa tan sinh khối trong 1ml dung dịch CaCl2 0,1M 15% glycerol. Ngâm trong nƣớc đá 30 phút.
b) Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt
- Đặt ống eppendorf chứa tế bào khả biến vào nƣớc đá ngay sau khi lấy ra
khỏi tủ lạnh.
- Bổ sung 2 - 5µl DNA plasmid vào, trộn đều. Giữ trong nƣớc đá 30 phút. - Chuyển nhanh dịch tế bào trên vào bể ổn nhiệt 420C trong 60 giây.
- Nhanh chóng chuyển dịch tế bào vào nƣớc đá để 1-2 phút.
- Cho vào 500 µl mơi trƣờng LB lỏng. Ni cấy lắc ở 370C, 200 vòng/phút trong 1 giờ.
c) Chọn lọc tế bào mang plasmid tái tổ hợp bằng phương pháp sàng lọc xanh - trắng.
Cấy trang 100μl hỗn hợp biến nạp trên môi trƣờng LB rắn có bổ sung Ampicilin (100mg/ml), X-gal (40mg/ml), IPTG (100mM). Nuôi trong tủ ấm 370C qua đêm.
2.2.1.7. Tách plasmid từ vi khuẩn E.coli
( Sambroook. J, Russel. DW, 2001)[51]
Tiến hành.
- Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli mang DNA plasmid cần tách chiết trong 3ml mơi trƣờng LB lỏng chứa trong ống fancol 15ml có bổ sung kháng sinh thích hợp. Ni ở tủ ấm 370C, lắc 200 vòng/phút, thời gian từ 12-16 giờ đến khi OD600 đạt 1-2.
- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 6000 vòng/phút trong thời gian 10 phút, 40C. Bỏ dịch nuôi.
- Cho 300µl Solution I, vortex cho tế bào tan đều.
- Bổ sung 400µl Solution II, lắc nhẹ nhàng trộn đều dung dịch để thành tế bào tan hết, đến khi dung dịch có màu trong suốt.
- Bổ sung 300µl Solution III, lắc nhẹ nhàng tới khi xuất hiện kết tủa trắng. - Ly tâm ở 40C, 6000 vòng/phút trong 10 phút. Dùng pipette hút dịch chuyển sang ống eppendorf 2ml đáy vuông sạch, bỏ phần kết tủa.
- Bổ sung 600µl resin, lắc đều.
- Chạy cột binding column, lắp vào máy hút chân không, rửa cột hai lần bằng nƣớc cất đã thanh trùng, mỗi lần dùng 1ml.
- Chuyển dung dịch vào cột, đợi cho dịch chảy hết qua cột thì tiến hành rửa cột. - Rửa cột hai lần bằng cồn 700 để lạnh. Mỗi lần dùng 1ml cồn.
- Đem cột ly tâm ở 40
C, 10.000 vòng/phút, trong 10 phút để loại cồn. - Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 20µl dung dịch đệm TE, để 1 phút. - Ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút ở 40
C. - Thu dịch chứa DNA, chạy điện di kiểm tra.
2.2.1.8. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR và enzyme giới hạn
a) Phản ứng PCR master mix Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) Master mix 2X - 12,5 H2O - 4.5 P1 10 µM 0,5 P2 10 µM 0,5 DNA plasmid 10 µg/µl 2 Tổng thể tích 20
Chu trình nhiệt Biến tính: 95ºC/ 5phút - 94ºC/ 30 giây - 60ºC/30 giây 30 chu kỳ - 72ºC/ 30 giây Kết thúc: 72º C/ 5 phút
Giữ sản phẩm PCR ở 4oC, chạy điện di để kiểm tra
b) Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn
- Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme EcoRI
Phản ứng cắt bằng EcoRI để kiểm tra sự có mặt của T4
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng xử lý pGEM - T/T4 bằng enzyme giới hạn
EcoRI
Thành phần Nồng độ Thể tích (μl)
H2O
Đệm cho EcoRI hoạt động
EcoRI DNA plasmid - 10X 10 u/µl 10 µg/µl 3 1 1 5 Tổng thể tích 10
Ủ ở 37oC trong vòng 2,5- 3h. Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả.
2.2.1.9. Tinh sạch DNA từ gel agarose
Tiến hành:
- Mẫu gel agarose có chứa băng DNA quan tâm đƣợc cắt ra và cho vào ống eppendorf 2 ml đáy vng sạch.
- Bổ sung 600µl Guanidine thiocynate 6M, lắc đều, làm nóng ở 600C để hịa tan hồn tồn.
- Tiếp đó thêm 600µl dung dịch resin, lắc đều và đƣa vào chạy cột binding column với máy hút chân không.
- Cột đƣợc rửa hai lần, mỗi lần sử dụng 1 ml cồn lạnh 700, sau đó đem cột ly tâm 10.000 vòng/phút, ở 40C trong 10 phút.
- Chuyển cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 20µl TE buffer, để 1-2 phút rồi đem ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu dung dịch chứa DNA đã tinh sạch.
2.2.1.10. Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
Xác định trình tự bằng máy giải trình tự gen tự động ABI 3100 (Applied Biosystems). Quy trình đƣợc thực hiện theo Kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing
2.2.2. Phƣơng pháp biểu hiện
Hình 2.4. Quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV
2.2.2.1. Thiết kế vector biểu hiện pET-32a(+)/T4
Vector biểu hiện tái tổ hợp đƣợc thiết kế bằng cách cài gắn đoạn gen T4 vào plasmid pET-32a(+) sau khi cả hai thành phần này cùng đƣợc xử lý bởi enzyme giới
Sản phẩm tách dòng gen T4 đƣợc tinh sạch
và xác định trình tự
Vector pET- 32a(+) đƣợc cắt bằng
EcoRI
Nối T4 vào pET-32a(+) tạo vector tái tổ hợp
Chuyển vector tái tổ hợp vào
E.coli BL21
Kiểm tra bằng điện di
SDS-PAGE
Kiểm tra bằng Western blot
hạn EcoRI. Phản ứng ghép nối đoạn gen T4 vào vector pET-32a(+) đƣợc thực hiện trong hỗn hợp với các thành phần đƣợc trình bày ở (bảng 2.7).
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 vào pET-32a(+) Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) ligase buffer T4 ADN pET-32a(+) T4 ligase H2O 10X 10 µg/ µl 10 µg/ µl 5 u/ µl - 1 2 1 1 5 Tổng thể tích 10
Phản ứng ghép nối đƣợc thực hiện trong 2 giờ ở nhiệt độ 22oC. Sau khi kết thúc, hỗn hợp đƣợc dùng để biến nạp vào E.coli BL21(DE3).
2.2.2.2. Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên tái tổ hợp trong tế bào E.coli BL2(DE3)
Sau khi plasmid tái tổ hợp mang gen T4 đƣợc biến nạp thành công vào tế bào biểu hiện E.coli BL21(DE3), protein tái tổ hợp đƣợc tiến hành biểu hiện theo các bƣớc:
- Nuôi tăng sinh một khuẩn lạc E. coli BL21 có chứa vector pET32a+-T4 (vector pET32a+ có chứa gene T4) trong ống fancol chứa 3 ml mơi trƣờng LB-Amp (100µg/ml) lỏng ở 370
C với tốc độ lắc 150 vòng/phút, để qua đêm (14-16h).
- Chuyển 800 µl dịch ni từ ống fancol sang bình tam giác có chứa 50 ml mơi trƣờng LB-Amp (100µg/ml) lỏng, tiếp tục nuôi ở 370
C với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong khoảng từ 1-2h.
- Khi OD600 = 0,6-0,8. Lấy 1,3 ml dịch nuôi cho vào ống effendof mới để làm mẫu chuẩn. Sau đó bổ sung IPTG cho tới khi nồng độ đạt 1mM vào dịch nuôi, tiếp tục nuôi lắc ở 300C, trong 6h tiếp theo.
- Tại các thời điểm sau khi bổ sung IPTG 2h, 4h, 6h. Lấy 1,3 ml dịch nuôi cho vào ống effendorf mới để thu protein.
- Ly tâm thu tế bào. Bổ sung từ 50-60µl dung dịch Sample buffer. Vortex để hịa tan tế bào. Ngâm trong nƣớc sơi từ 10-15p.
- Sản phẩm biểu hiện sẽ đƣợc tinh sạch bằng phƣơng pháp sử dụng cột ái lực Ni2+.
2.2.2.3. Tinh sạch protein tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni2+
Quy trình tinh sạch bao gồm các bƣớc:
1. Ly tâm 400 ml dịch tế bào đã kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp
với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút rồi tiến hành thu cặn.
2. Thêm 15 ml dung dịch đệm gắn (Binding buffer), ủ trong đá 5 phút.
3. Tiến hành ly tâm để phá vỡ thành tế bào với chu kỳ 30 giây/lần, nghỉ 30 giây trong 20 phút.
4. Chia nhỏ dung dịch ra các ống eppendorf 2 ml, tiến hành ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút rồi thu dịch.
5. Phần dịch nổi chứa protein tái tổ hợp đƣợc đƣa lên cột Nickel - Chelating Resin đã chuẩn bị truớc. Đảo đều trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Cố định cột theo chiều thẳng đứng cho dịch chảy ra từ từ.
6. Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Binding Buffer (8 M Urea; 20 mM Sodium phosphate pH = 7,8; NaCl 500 mM).
7. Rửa cột 2 lần bằng 4 ml Denaturing Wash Buffer (8 M Urea; Sodium phosphate 20 mM pH = 6; NaCl 500 mM).
8. Rửa cột 4 lần bằng 8 ml Native Wash Buffer (Native Purification Buffer và Imidazole pH = 6).
9. Thu protein tái tổ hợp bằng 6 ml Native Elution Buffer, thu 5 phân đoạn mỗi phân đoạn 1 ml.
Sản phẩm tinh sạch đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide.
2.2.2.4. Điện di protein trên gel polyacrylamide (SDS - PAGE)
a) Nguyên tắc
Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE còn đƣợc gọi là phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamide không liên tục và mẫu protein đã đƣợc biến tính bằng tác nhân biến tính. Dƣới tác dụng của điện trƣờng các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dƣơng.
b) Quy trình
Pha gel polyacrylamide.
Pha gel cơ với nồng độ 15%.
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Fancol 50ml sạch : 0,5ml H20 cất hai lần; 1,9 ml Tris– HCl 1M pH 8,8; 2,5ml Acrylamide; 50µl 10% SDS; 50µl 10% Amonium persulfate; 2µl TEMED.
Pha gel tách nồng độ 5%
Cho các thành phần sau theo thứ tự vào ống Fancol 50 ml khác: 1,38ml H2O; 250µl Tris– HCl 0,5 M pH 6,8; 330µl Acrylamide; 20µl SDS 10%, 20µl Amonium persulfate 10%; 2µl TEMED.
Tiến hành điện di và xem kết quả
- Dùng pipette hút lấy 20µl dung dịch protein đã đƣợc biến tính và 10µl Marker Protein chuẩn nạp mẫu vào các giếng sao cho mẫu khơng bì tràn ra khỏi giếng.
- Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 65V, cƣờng độ dòng điện là 400mA trong thời gian 30 phút để mẫu chạy hết bản gel phía trên. Sau đó, chạy điện