3.6. Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình chuẩn bị mẫu
3.6.2. Hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch với cột silicagel đa lớp
Cấu tạo của cột Silicagel đa lớp sử dụng:
1 0 . 0 0 1 1 . 0 0 1 2 . 0 0 1 3 . 0 0 1 4 . 0 0 1 5 . 0 0 1 6 . 0 0 1 7 . 0 0 1 8 . 0 0 5 8 6 0 6 2 6 4 6 6 6 8 7 0 7 2 7 4 7 6 7 8 8 0 8 2 8 4 8 6 8 8 9 0 9 2 9 4 T i m e - - > A b u n d a n c e T IC : D IO X IN H U N G 2 5 0 2 0 8 0 2 .D \ d a ta s i m .m s T IC : D IO XI N M2 . 4 8 h 2 0 0 2 0 8 0 2 . D \ d a t a s i m . m s
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Chun ngành Hóa phân tích
Hình 3.12: Cấu tạo của cột Silicagel đa lớp của hãng Supelco
Tiến hành thực nghiệm nhƣ sau:
Hoạt hóa cột bằng cách cho 200ml n - hexan qua cột với lƣu lƣợng cỡ 3ml/phút và luôn giữ lại lớp n-hexan cao hơn bề mặt của pha tĩnh (không để pha tĩnh bị khơ). Sau khi hoạt hóa, cột silicagel đa lớp đã sẵn sàng để sử dụng.
Phân tích chất chuẩn có nồng độ 100pg/µl 2,3,7,8 – TCDD trên máy (ký hiệu MCOT1).
Lấy 1ml chất chuẩn có nồng độ 100pg/µl 2,3,7,8 – TCDD cho qua cột, cho thêm 100ml n-hexane để rửa dịch chiết qua cột với tốc độ 1-1,5ml/phút và thu hỗn hợp ra khỏi cột cho vào bình, cơ đặc đến 1ml, sau đó phân tích trên máy (Ký hiệu MCOT2), kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
0,9g Silicagel
3g Silicagel thấm AgNO3 10% loại bỏ hợp chất chứa sun fua
3g Silicagel thấm KOH 2% loại bỏ hợp chất có tính axit 4,5g Silicagel thấm H2SO4 44% để thủy phân các chất béo
6g Silicagel thấm H2SO4 22%, loại bỏ nền và thủy phân các chất béo.
6g NaSO4 10% loại bỏ H2O trong quá trình tách chiết (ngƣời sử dụng thêm vào)
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hình 3.13: Sắc đồ của mẫu chuẩn có nồng độ 100pg/µl trước khi qua cột Silicagel
# min scan scan scan TY height area % max. total --- ----- ----- ---- ---- --- ------- ------- ------ ------- 1 10.866 866 874 927 BV 6700 207234 100.00% 100.000% 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 Time--> Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT1.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Chun ngành Hóa phân tích
Hình 3.14: Sắc đồ của mẫu chuẩn có nồng độ 100pg/µl sau khi qua cột Silicagel
# min scan scan scan TY height area % max. total --- ----- ----- ---- ---- --- ------- ------- ------ -------
1 10.871 845 875 908 BV 6099 186098 100.00% 98.908%
Nhận xét: từ kết quả trên cho thấy hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch bằng cột silicagel đa lớp đạt 6069/6700 = 90,58%. Kết quả này phù hợp khoảng hiệu suất thu hồi mà nhà sản xuất đƣa ra (đạt trên 85%).
3.6.3. Hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch với cột carboxen 2 lớp
Cấu tạo của cột Carboxen 2 lớp sử dụng:
4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 Time--> Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT2.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hình 3.15: Cấu tạo của cột Carboxen 2 lớp của hãng Supelco
Tiến hành thực nghiệm nhƣ sau:
Trƣớc khi sử dụng cột than 2 lớp, tiến hành hoạt hóa cột bằng cách: cho 40ml Toluene qua cột với tốc độ cỡ 1-2ml/phút. Sau đó cho tiếp 50ml n-hexane qua cột với cũng với tốc độ nhƣ trên, tiếp tục cho thêm 50ml n-hexane qua cột lần thứ 2, loại bỏ toàn bộ dung dịch qua cột.
Lấy 1ml chất chuẩn có nồng độ 100pg/µl 2,3,7,8 – TCDD cho qua cột than, cho tiếp 30ml hỗn hợp dung môi dichloromethane 3,3% (V/V) trong n-hexane đi qua cột với tốc độ cỡ 1-2ml/phút. Loại bỏ phần dung dịch qua cột.
Tiến hành rửa giải phân đoạn PCDD/PCDF bằng 120ml Toluene chia làm 3 lần, mỗi lần 40ml qua cột với tốc độ cỡ 1-2ml/phút. Thu phần dung dịch qua cột và
Lớp Cacbon – 1016, diện tích bề mặt = 75 m2 /g Lớp Cacbon – 1000, diện tích bề mặt = 1200 m2/g Dòng mẫu
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Chun ngành Hóa phân tích
# min scan scan scan TY height area % max. total --- ----- ----- ---- ---- --- ------- ------- ------ ------- 1 10.866 866 874 927 BV 6700 207234 100.00% 100.000% 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 50 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 Time--> Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT1.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Hình 3.16: Sắc đồ của mẫu chuẩn có nồng độ 100pg/µl sau khi qua cột Carboxen
# min scan scan scan TY height area % max. total --- ----- ----- ---- ---- --- ------- ------- ------ -------
1 10.884 873 869 913 BV 3326 105246 100.00% 76.925%
Nhận xét: từ kết quả trên cho thấy hiệu suất thu hồi của quá trình làm sạch bằng cột than 2 lớp đạt 3326/6700 = 49,64%.
Thực tế, nhà sản suất cột Carboxen 2 lớp không đƣa ra giá trị hiệu suất thu hồi có thể đạt đƣợc sau q trình làm sạch với cột than vì bản chất của quá trình này là dioxin sẽ bị giữ lại cột than, sau đó đƣợc rửa giải bằng hỗn hợp dung mơi thích hợp, thu hồi lại dioxin. Do đó, lƣợng dioxin thu lại đƣợc trong quá trình này phần lớn phụ thuộc vào lƣợng hỗn hợp dung môi rửa giải và thao tác của cán bộ phân tích.
3.7. Đánh giá khả năng phân tích các hợp chất dioxin/furan
Để đánh giá khả năng ứng dụng và độ tin cậy của phƣơng pháp GC-MS/NCI, một số yếu tố nhƣ: Giới hạn phát hiện; Độ tuyến tính và khoảng tuyến tính; độ chụm và độ đúng của phƣơng pháp đã đƣợc nghiên cứu. Lần lƣợt kiểm tra từng yếu tố trên bằng cách phân tích chất chuẩn với 2 kỹ thuật GC-MS/NCI; GC-MS/EI để so sánh, đánh giá. Time--> 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 500 1000 1500 2000 2500 3000 Abundance
TIC: CHUAN DIOXIN MCOT3.D\DATASIM.MS
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Chun ngành Hóa phân tích
3.7.1. Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với một chất đƣợc định nghĩa là hàm lƣợng nhỏ nhất của chất đó có trong mẫu mà tại hàm lƣợng đó, mẫu chất có tín hiệu lớn hơn 2,5 lần tín hiệu nhiễu trung bình khi áp dụng phƣơng pháp đó để phân tích [24, 25]. Nói cách khác, để đánh giá giới hạn phát hiện của phƣơng pháp với 1 chất, cần tiến hành làm giảm nồng độ chất phân tích đến khi nào pic của chất đó có giá trị tín hiệu/nhiễu (S/N) đạt giá trị 2,5. Khi đó, hàm lƣợng của chất tại thời điểm đấy chính là giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với chất đó. Giới hạn phát hiện là một thơng số quan trọng đánh giá giá trị sử dụng của phƣơng pháp. Các nhà khoa học đã và đang khơng ngừng nghiên cứu, tìm các giải pháp kỹ thuật để hạ thấp hơn nữa giới hạn phát hiện với các chất.
Trƣớc hết, sử dụng dãy chất chuẩn chứa các chất dioxin/furan với nồng độ 0,5 đến 2,5 pg/l, phân tích trên máy ở 2 chế độ ion hóa là EI và NCI kết hợp giám sát các ion đơn (SIM) đƣợc đƣa ra trong bảng 3.4 và bảng 3.1 để đánh giá ban đầu.
Bảng 3.4: Các ion dương được giám sát khi phân tích EI phân tích mẫu các chất dioxin/furan
Tetra Penta Hexa Hepta Octa PCDFs 306 340 374 410 442 PCDDs 322 356 390 426 460
Sau khi phân tích, tỷ số giữa tín hiệu của pic và nhiễu (S/N) của các ion đặc trƣng của mỗi chất đƣợc tính và liệt kê ở bảng 3.5.
Bảng 3.5: Tỷ lệ tín hiệu/nhiễu khi phân tích 17 đồng loại độc dioxin/furan nồng độ 0,5 đến 2,5pg/l bằng kỹ thuật GC-MS/EI và GC-MS/NCI
TT Tên chất Nồng độ (pg/l) S/N (Tín hiệu/ Nhiễu) GC-MS/EI GC-MS/NCI 1 2,3,7,8-TCDD 0,5 2,80 KPH 2 1,2,3,7,8-PeCDD 0,5 8,47 19,8 3 1,2,3,4,7,8-HxCDD 1,25 4,96 100,2
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 1,25 4,98 311,5 5 1,2,3,7,8,9-HxCDD 1,25 3,98 38,7 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,25 2,99 176,5 7 OCDD 2,5 5,86 905,4 8 2,3,7,8-TCDF 0,5 2,56 44,4 9 1,2,3,7,8-PeCDF 0,5 8,52 1.137 10 2,3,4,7,8-PeCDF 0,5 8,10 992,6 11 1,2,3,4,7,8-HxCDF 1,25 7,74 2.789 12 1,2,3,6,7,8-HxCDF 1,25 9,00 3.795 13 1,2,3,7,8,9-HxCDF 1,25 6,53 2.837 14 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,25 3,96 1.181 15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 1,25 6,44 3.740 16 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1,25 3,31 1.929 17 OCDF 2,5 5,89 4.137
Kết quả cho thấy, ở cùng điện thế cấp của detector khối lƣợng là 1600V, phân tích dãy các chất dioxin/furan với nồng độ 0,5 – 2,5 pg/l, với kỹ thuật EI, một số đồng loại độc nhƣ 2,3,7,8-TCDD; 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF; 1,2,3,4,6,7,8- HpCDD; 2,3,7,8-TCDF, đã chạm đến giới hạn phân tích định tính. Tuy nhiên, khi dùng NCI, chiều cao pic của hầu hết các chất đều lớn hơn gấp nhiều lần so với EI. Tất cả 10 đồng loại độc của Furans đạt kết quả rất tốt, các pic thu đƣợc có tỷ lệ S/N cao gấp 17 đến hơn 700 lần. Các đồng loại độc của dioxin (ngoại trừ 2,3,7,8- TCDD) cũng cho kết quả tốt hơn rất nhiều so với kỹ thuật EI. Đặc biệt các đồng loại độc dioxin/furan chứa từ 6 đến 8 nguyên tử clo cho kết quả rất tốt với NCI.
Tiếp tục thay đổi nồng độ của các chất dioxin/furan trong mẫu và phân tích bằng cả 2 kỹ thuật để xác định giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với nhóm dioxin/furan. Kết quả thử nghiệm đƣợc đƣa ra trong bảng 3.6.
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
Chun ngành Hóa phân tích
TT Tên chất EI NCI Nồng độ (pg/l) S/N Nồng độ (pg/l) S/N 1 2,3,7,8-TCDD 0,5 2,8 2,5 2,6 2 1,2,3,7,8-PeCDD 0,2 2,8 0,075 2,7 3 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,5 2,6 0,045 2,8 4 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,5 2,6 0,015 2,7 5 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0,5 2,3 0,085 2,6 6 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 1,25 3,0 0,035 2,7 7 OCDD 0,5 2,7 0,0075 2,8 8 2,3,7,8-TCDF 0,5 2,6 0,04 2,9 9 1,2,3,7,8-PeCDF 0,2 2,7 0,001 3,0 10 2,3,4,7,8-PeCDF 0,2 2,6 0,001 2,6 11 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,5 2,2 0,001 2,7 12 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,5 2,8 0,0075 2,5 13 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,75 3,2 0,001 2,8 14 2,3,4,6,7,8-HxCDF 1,0 3,6 0,003 2,9 15 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,75 3,1 0,0075 2,5 16 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 1,25 3,31 0,0015 2,4 17 OCDF 1,25 2,7 0,0015 2,6
Quan sát bảng 3.6 ta thấy, tại các nồng độ đƣợc thử nghiệm, tỷ số S/N xấp xỉ 2,5 đã gần tới giới hạn phát hiện của phƣơng pháp đối với mỗi chất. Với phƣơng pháp GC-MS/EI thì 2,3,4,7,8-PeCDF là chất có giới hạn phát hiện thấp nhất (xấp xỉ 0,2pg/l) đây cũng là ngƣỡng giới hạn phát hiện tốt đối với kỹ thuật MS/EI. Tuy nhiên, khi quan sát kết quả phân tích với kỹ thuật MS/NCI ta thấy giới hạn định lƣợng của mỗi chất đƣợc hạ thấp xuống rất nhiều, đặc biệt là nhóm chất furan, giới hạn phát hiện đã hạ thấp xuống hàng nghìn lần so với MS/EI và có thể phát hiện
Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Nguyễn Thị Phƣơng – K22
đến lƣợng chất cỡ femtogram, đây là một ngƣỡng phân tích rất thấp mà thơng thƣờng chỉ có kỹ thuật khối phổ phân giải cao mới đạt đƣợc.
Một hạn chế lớn của NCI là rất kém nhạy đối với đồng loại độc độc nhất, quan trọng nhất của các chất dioxin/furan là 2,3,7,8-TCDD, giới hạn định lƣợng của nó là 2,5pg/l, cao gấp 5 lần so với kỹ thuật MS/EI. Do đó, khi phân tích ở hàm lƣợng siêu vết mà sử dụng NCI ví dụ nhƣ trong phân tích kiểm tra hàm lƣợng các chất dioxin/furan trong máu, trong thực phẩm, vẫn cần phải sử dụng khối phổ phân giải cao để kiểm chứng sự tồn tại của 2,3,7,8-TCDD trong mẫu.
Tuy nhiên, chúng ta hồn tồn có thể sử dụng NCI trên máy khối phổ phân giải thấp để phân tích, đánh giá sơ bộ hàm lƣợng dioxin/furan với lƣợng siêu vết (cỡ vài chục femtogram) mà không cần dùng thiết bị khối phổ phân giải cao để hạ giá thành đầu tƣ thiết bị, giá thành phân tích mẫu.