2.1.2. Hóa chất
Sử dụng các loại hóa chất tinh khiết và thông dụng có nguồn gốc từ Anh, Đức, Mỹ, Thụy Điển, Trung Quốc như: CTAB, EDTA, tris, ethanol, natri clorua, đệm PCR, Taq DNA polymerase, MgCl2, dNTPs, agarose và các hóa chất khác được mua của hãng Invitrogen.
- Các hóa chất dùng trong phân lập gen như Taq polymerase, buffer PCR, SDS, EDTA, Tris... của Invitrogen.
- Cặp mồi nhân gen CHI được thiết kế dựa trên sự phân tích trình tự gen CHI của giống đậu xanh được công bố tại ngân hàng GenBank - NCBI với mã số NM_001317294.1.
Bảng 2.1. Cặp mồi nhân gen CHI
Mồi Trình tự mồi (5’-3’) Nhiệt độ gắn mồi Kích thước dự kiến từ khuôn từ cDNA CHI-F ATGGCAACAAAGCACCCAC 56oC 669 bp CHI-R TCAGAGTATA ATGCCGTCCT 56oC
- Vector tách dòng pBT của Viện Công nghệ Sinh học.
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR QIAquick Gel Extraction Kit, tinh sạch sản phẩm PCR AccuPrep PCR Purification Kit (Bioneer), bộ kit tách dòng TA Cloning Kit (Invitrogen), bộ kit tách plasmid tái tổ hợp AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit (Bioneer)...
- Các loại hóa chất khác: agarose, cồn tuyệt đối, sorbitol, chloroform... của Việt Nam, Trung Quốc sản xuất.
2.1.3.Thiết bị
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị đã sử dụng
STT Thiết bị Nguồn gốc, xuất xứ
1 Máy PCR Applied Biosystem - Mỹ
2 Bộ điện di Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd. - Anh
3 Bể ổn nhiệt Memmert - Đức
4 Máy ly tâm Thermo Sci Legend Micro 21R - Mỹ 5 Máy chụp ảnh gel Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ
6 Máy lắc Vortex IKA Minishaker MS1 - Đức 7 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Nu-425-400E Nuaire - Mỹ 8 Cân điện tử Precisa XB1200C - Đức
9 Máy lọc nước deion AquaMax Ultra YoungUn - Hàn Quốc 10 Máy cất nước Cascada Bio-Water - Pall Life - Mỹ/Anh 11 Máy đo quang phổ định lượng NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹ 12 Máy DNA sequencing ABI Prism 3100 - Mỹ
13 Tủ lạnh -20oC Sanyo - Nhật Bản
14 Tủ lạnh -84oC Super Freezer Eco130 - Ficchetti - Ý
15 Tủ ấm IB-15G Jeiotech - Hàn Quốc
16 Bể ổn nhiệt BW-05G Jeiotech - Hàn Quốc
Các thí nghiệm phân lập gen, giải trình tự nucleotide đươ ̣c thực hiê ̣n ta ̣i Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghê ̣ gen, Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và mRNA tổng số
Ngâm ủ hạt đậu xanh cho nảy mầm rồi gieo trên cát sạch, khi cây được 5 - 7 ngày tuổi sử dụng lá để tách DNA tổng số và tách mRNA tổng số.
* Phương pháp tách DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết theo theo Gawel và cs năm 1991 có cải tiến [15] bao gồm các bước như sau:
+ Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
+ Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần.
+ Thêm 700 µl đệm tách, trộn nhẹ. Ủ ở 65o C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Thêm 600 µl Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), trộn đều 20 phút (dung máy trộn càng tốt)
+ Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút.
+ Hút 500 µl dịch trong ở pha trên sang ống Eppendorf 1,5 µl bỏ tủa.
+ Thêm 500 µl Isopropanol, trộn nhẹ, đặt lên đá chờ có tủa trắng.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô.
+ Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ.
+ Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt.
+ Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion.
* Phương pháp tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết bằng cách sử dụng TRIzol reagents (Invitrogen). Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều được khử DEPC 0,01%. Các bước tiến hành như sau:
+ Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng chày cối đã khử trùng.
+ Bổ sung 1ml TRIzol reagents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút. + Bổ sung 500µl Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40oC.
+ Lấy 600µl dịch nổi sang Eppendorf mới loại 1,5ml.
+ Bổ sung 300µl (isopropanol) + 50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút. + Ly tâm 8000vòng/phút trong 20 phút ở 40 oC.
+ Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
+ Rửa RNA bằng cồn 70% (đã pha trong DEPC 0,01%). + Ly tâm 10000vòng/phút trong 10 phút. Lăp lại 2 lần. + Làm khô 5 phút trong box bật quạt.
+ Pha loãng RNA trong 40µl nước khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC để RNA tan hết.
+ Mẫu mRNA thu được bảo quản trong tủ -84 oC.
Từ RNA tổng số tinh sạch, phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA từ mRNA theo bộ kit ReverdAid First Stand cDNA Synthesis (Thermo Scientific). Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA thể hiện ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần của phản ứng tổng hợp cDNA
TT Thành phần Thể tích (µl)
1 Mồi OligoT 1
2 RNA tổng số 6
3 H2O (DEPC) 5
Trộn nhẹ, ủ ở 65oC trong 5 phút, sau đó cho ngay vào đá. Tiếp theo bổ sung thêm các thành phần sau:
4 5X Reaction Buffer 4
5 RiboLock Rnase Inhibitor (20 U/µl) 1
6 dNTP 10 Mm 2
7 RevertAid H Minus Transcriptase (200 U/µl) 1
Tổng thể tích 20
Ủ 25oC trong 5 phút, 42oC trong 60 phút, ủ 70oC trong 5 phút. Bước cuối ủ 4oC.
Sau khi tách chiết được DNA tổng số và tổng hợp cDNA, chúng tôi thực hiện khuếch đại gen CHI bằng phản ứng PCR với cặp mồi CHI-F và CHI-R được thiết kế dựa trên trình tự gen CHI. Thành phần phản ứng PCR nhân gen
CHI của cây đậu xanh được trình bày ở bảng sau:
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen CHI
STT Thành phần Thể tích (μl) 1 PCR Master Mix 12,5 µl 2 DNA tổng số (50ng/µl); cDNA 1 µl; 1 µl 3 Mồi CHI-F (10pM/µl) 1 µl 4 Mồi CHI-R (10pM/µl) 1 µl 5 H2O 9,5 µl Tổng 25 µl
Phản ứng PCR nhân gen CHI được thực hiện với chu trình nhiệt như sau:
Bảng 2.5. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen CHI Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
Biến tính 94 3 phút 1
Biến tính 90 30 giây
30
Gắn mồi 56 30 giây
Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,0% và được tinh sạch. Quá trình làm sạch sản phẩm PCR phục vụ việc tạo dòng được thực hiện với bộ kit AccuPrep PCR Purification Kit:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm và soi. Cắt lấy băng quan tâm (chứa đoạn gel có kích thước yêu cầu).
- Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5 (quy ước 1μl tương đương 1mg mẫu).
- Ủ ở 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500μl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.
- Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30μl dung lịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem
ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20oC.
- Điện di kiểm tra sản phẩm làm sạch gen CHI.
2.2.4. Tách dòng gen CHI
- Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector như sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen CHI vào vector pBT
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 H2O 2
2 Buffer T4 ligase (10X) 1
3 Enzyme ligation (10 unit/µl) 1
4 Vector pBT 1
5 Sản phẩm PCR tinh sạch 5
Tổng 10
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α
Sau khi thực hiện phản ứng ghép nối gen quan tâm và vector pBT, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α. Quy trình thực hiện như sau:
+ Lấy 5µl sản phẩm của phản ứng ghép nối gen cho vào ống tế bào khả biến (50µl), để trên đá trong 10 phút.
+ Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, sau đó để ngay vào đá trong 10 phút.
+ Bổ sung 300µl LB lỏng để nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong 1 giờ.
+ Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin, IPTG và X- gal (Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch nổi giữ lại 150 µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường môi trường cấy trải có kháng sinh carbenicillin. Ủ đĩa petri ở 37oC trong 16 giờ).
+ Chọn khuẩn lạc có màu trắng đem nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin (tỉ lệ 1000LB lỏng: 1carbenicillin). Nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ.
- Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR
Lấy dịch nuôi vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi nhân gen CHI. Sản phẩm PCR chọn dòng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%
- Tách plasmid tái tổ hợp
Tách chiết plasmid bằng bộ kit Plassmid Miniprep Kit của hãng Qiagen theo quy trình sau:
+ Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Sau đó loại bỏ dịch nổi, thu cặn.
+ Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch.
+ Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.
+ Sau đó bổ sung 500μl dung dịch Chlorofom:Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20oC trong 20 phút.
+ Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi.
+ Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% .
- Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn: plasmid được tách chiết sau đó
được phân tích bằng enzyme giới hạnh theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.5. Phương pháp xác định trình tự nucleotide
Các mẫu plasmid mang gen quan tâm có kích thước phù hợp với lý thuyết được sử dụng để giải trình tự bằng máy xác định trình tự tự động ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems - Mỹ).
2.2.6. Phương pháp phân tích trình tự gen
Sử dụng phần mềm BLAST, BioEdit, Gendoc và ClustalW2 để phân tích và so sánh các trình tự gen.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo dòng và xác định trình tự gen CHI từ DNA genome
3.1.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Vì DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở mức phân tử. Chất lượng của DNA tổng số có vai trò quan trọng quyết định sự thành công của các thí nghiệm phân tích sinh học phân tử. Do đó, chúng tôi tiến hành tách chiết DNA của 2 giống đậu xanh nghiên cứu ở giai đoạn lá non 7 ngày tuổi theo phương pháp của Gawel và cs (1991) [15].
Trong quy trình tách chiết đã sử dụng tác nhân lý, hóa học vì thế mà ít hay nhiều ảnh hưởng tới độ nguyên vẹn của nucleic acid. Bởi vậy chúng tôi phải kiểm tra mức độ nguyên vẹn của DNA bằng điện di trong gel agarose 0,8%, kết quả thể hiện trong hình 3.1.