Phản ứng đầu tiên là một aminno acid L-phenylalanine loại bỏ đi nhóm amin để tạo ra axit cinnamic qua các enzyme lyase phenylalaninen ammonia (PAL). Đầu tiên, phenylalanine phản ứng với malonyl CoA để tạo thành 4 hydroxycinnamoyl CoA. Dưới sự kiểm soát xúc tác của chalcone synthase, 4- CoA hydroxycinnamoyl ngưng tụ với ba phân tử malonyl CoA để tạo thành một chalcone. Isomerase chalcone xúc tác đóng vòng của vòng dị vòng. Isoflavone synthase gắn một nhóm 2-hydroxyl, sau đó được gỡ bỏ bởi một dehydratase isoflavone để tạo thành daidzein (7,4'-dihydroxyisoflavone) và genistein (5,7,4'- trihydroxyisoflavone) [32].
1.3.2. Gen tổng hợp Isoflavone
Hai enzyme chìa khóa quan trọng trong con đường sinh tổng hợp Isoflavone là chalcone isomerase (CHI) và isoflavone synthase (IFS) [19].
Chalcone isomerase (CHI) là enzyme thứ hai trong con đường sản sinh flavonoid và xúc tác chuyển đổi 1 chalcone 1 flavanone – là nguyên liệu để tạo ra flavonoid và isoflavonoid [12]. CHI phân lập từ thực vật không thuộc cây họ đậu không thể sử dụng isoliquiritigenin như một chất nền vì vậy CHI được phân thành hai loại chính là loại I và loại II [21]:
Loại I: CHI có thể xúc tác cho 6-hydrox-chalcone tạo thành (2S)– flavonoid hoặc (2S)–5- desoxidation flavonoid. CHI đã được tìm thấy trong hầu hết các loại thực vật cả thực vật họ đậu cũng như không thuộc họ đậu có thể kể đến như lúa mạch, Arabidopsis và lúa [6].
Loại II: CHI chủ yếu tìm thấy trong cây họ đậu có thể xúc tác cho cả 6- hydrox-chalcone và 6-deoxidation-chalcone vào (2S)-flavonoid hoặc (2S)-5- desoxidation flavonoid [13].
Năm 1994, Heather và Ann H đã phân lập được hai gen CHI ký hiệu là
CHI1, CHI2 với kích thước lần lượt là 666 bp và 845 bp từ cDNA của cỏ linh
lăng (Medicago sativa L.) [18].
Grotewold và Peterson đã phân lập được 1 gen CHI từ cây ngô và thấy rằng các gen mã hóa một sản phẩm ZmCHI1 24,3 kDa tương ứng. Gen CHI1
ngô này có cấu trúc intron-exon và có bốn exon [16].
Terai và cs đã nghiên cứu phân lập được gen CHI từ cDNA của cây sắn
dây Pueraria lobata với kích thước gen là 675 bp mã hóa một polypeptide
225 amino acid, trọng lượng phân tử 23,8kDa. Gen CHI (cDNA) đã được gắn vào vector biểu hiện pET-3d và biểu thành công trong Escherichia coli [34].
Năm 2003, Norimoto Shimada và cs đã phân lập được 3 gen: CHI1,
CHI2 và CHI3 từ cDNA của cây L. japonicus và công bố trên ngân hàng
GenBank; CHI1 với mã số AB054801, chiều dài 681pb, mã hóa cho chuỗi polypeptide 226 amino acid (24,4 kD); CHI2 mã số AB054802, chiều dài 666pb, mã hóa cho chuỗi polypeptide 221 amino acid (23,9 kD)
và CHI3 với mã số AB073787, chiều dài 678pb, mã hóa cho 225 amino acid (24,2 kD) [30].
Gen CHI cũng được phân lập từ mRNA lá cây nho (Vitis vinifera L.) bởi tác giả Gutha LR và cs. Kết quả nghiên cứu phân lập được gen CHI có chiều dài 979bp, mã hóa cho 234 amino acid [17].
Gen IFS cũng đã được Misra P. và cs phân lập từ cDNA của cây
Psoralea corylifolia, một cây dược liệu quý của Ấn Độ. Gen có chiều dài
1563bp và mã hóa cho 520 amino acid [29].
Ở cây đậu tương, gen IFS đã được phân lập 2 gen đồng phân gồm IFS1
có chiều dài 1625bp và IFS2 có chiều dài 1824bp cùng mã hóa cho một sản phẩm có 521 amino acid [20].
1.3.3. Gen tổng hợp Isoflavone CHI ở cây xanh
Trong ngân hàng gen quốc tế (GenBank), gen CHI của đậu xanh đã được công bố tại ngân hàng GenBank - NCBI với mã số NM_001317294.1.
Thông tin về gen CHI của đậu xanh trên NCBI cho thấy gen nằm trên NST số 8. Số lượng nucleotide của gen là 1272bp, trình tự ORF của gen là 669bp, mã hóa cho 222 amino acid.
Chương 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, thiết bị, hóa chất và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu
Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là 02 giống đậu xanh: Giống ĐXHL10 do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm thuộc Bộ Nông nghiệp cung cấp, và giống đậu tằm (Đậu Mốc) thu thập tại địa phương (xã Động Lâm, huyện Hạ Hòa, tỉnh Phú Thọ) ký hiệu là ĐXĐP.
Giống đậu xanh ĐXHL10 được chọn tạo từ tổ hợp (BPI MG 50-10A x V87-13), theo phương pháp gia phả truyền thống. ĐXHL10 là sản phẩm của đề tài cấp Bộ “Nghiên cứu chọn tạo giống và các biện pháp canh tác đậu xanh cho các vùng trồng chính giai đoạn 2011-2013”. Giống đậu xanh ĐXHL10 có các đặc điểm chính: thời gian sinh trưởng: 62-65 ngày, chiều cao cây 50- 64cm, lá xanh trung bình. Ra hoa và chín tập trung, tỷ lệ thu hoạch lần 1 đạt khoảng 75-85%. Vỏ quả khi chín màu đen, dài khoảng 10-12cm. Hạt màu xanh sáng, cấp hạt đều, đóng hạt chặt. Trọng lượng 1000 hạt 63-68g tuỳ theo mùa vụ, hàm lượng protein 17,9%.
a b