Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ
Biến tính 94 3 phút 1
Biến tính 90 30 giây
30
Gắn mồi 56 30 giây
Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1
Kết thúc phản ứng 4 ∞
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,0% và được tinh sạch. Quá trình làm sạch sản phẩm PCR phục vụ việc tạo dòng được thực hiện với bộ kit AccuPrep PCR Purification Kit:
- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm và soi. Cắt lấy băng quan tâm (chứa đoạn gel có kích thước yêu cầu).
- Bổ sung đệm hòa tan (GB - Gel binding buffer) theo tỷ lệ Vmẫu : VGB = 1 : 5 (quy ước 1μl tương đương 1mg mẫu).
- Ủ ở 60oC trong 10 phút, khoảng 2-3 phút lắc nhẹ một lần, sau khi gel tan hết thì ủ thêm 5 phút để gel tan hoàn toàn.
- Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột tinh sạch, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột.
- Bổ sung 500μl đệm GB vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Sau đó đem ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bước này nhằm loại bỏ hoàn toàn những thành phần gel agarose còn sót lại.
- Rửa màng lọc chứa DNA bằng cách thêm 500μl đệm rửa WB (Washing buffer) lên cột. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Ly tâm lần hai để đảm bảo loại bỏ hết dịch WB.
- Chuyển cột sang ống Eppendorf mới, bổ sung 30μl dung lịch đệm EL (Elution buffer) lên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó đem
ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ cột, thu dịch chứa mẫu DNA đã tinh sạch chuyển sang ống mới. Bảo quản ở -20oC.
- Điện di kiểm tra sản phẩm làm sạch gen CHI.
2.2.4. Tách dòng gen CHI
- Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector như sau: