2.1.3 .Thiết bị
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.4. Tách dòng gen CHI
- Nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR thu nhận được sau khi tinh sạch sẽ được gắn trực tiếp vào vector pBT. Thành phần của phản ứng gắn gen vào vector như sau:
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng nối gen CHI vào vector pBT
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 H2O 2
2 Buffer T4 ligase (10X) 1
3 Enzyme ligation (10 unit/µl) 1
4 Vector pBT 1
5 Sản phẩm PCR tinh sạch 5
Tổng 10
- Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. coli DH5α
Sau khi thực hiện phản ứng ghép nối gen quan tâm và vector pBT, tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào E.coli DH5α. Quy trình thực hiện như sau:
+ Lấy 5µl sản phẩm của phản ứng ghép nối gen cho vào ống tế bào khả biến (50µl), để trên đá trong 10 phút.
+ Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút 30 giây, sau đó để ngay vào đá trong 10 phút.
+ Bổ sung 300µl LB lỏng để nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37oC trong 1 giờ.
+ Cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung carbenicilin, IPTG và X- gal (Mẫu sau khi nuôi phục hồi li tâm 4000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch nổi giữ lại 150 µl trộn nhẹ. Sử dụng que cấy trải đã khử trùng, trải 150 µl dịch khuẩn lên đĩa môi trường môi trường cấy trải có kháng sinh carbenicillin. Ủ đĩa petri ở 37oC trong 16 giờ).
+ Chọn khuẩn lạc có màu trắng đem nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung carbenicillin (tỉ lệ 1000LB lỏng: 1carbenicillin). Nuôi ở 37oC, lắc 200 vòng/phút, trong 16 giờ.
- Kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng phản ứng PCR
Lấy dịch nuôi vi khuẩn kiểm tra sản phẩm chọn dòng bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi nhân gen CHI. Sản phẩm PCR chọn dòng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%
- Tách plasmid tái tổ hợp
Tách chiết plasmid bằng bộ kit Plassmid Miniprep Kit của hãng Qiagen theo quy trình sau:
+ Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 5 phút, 4oC. Sau đó loại bỏ dịch nổi, thu cặn.
+ Bổ sung 100μl dung dịch Sol I (lạnh), sau đó lắc nhẹ dịch.
+ Bổ sung 150μl dung dịch Sol III (lạnh), đảo nhẹ và để trên đá trong 10 phút.
+ Sau đó bổ sung 500μl dung dịch Chlorofom:Isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ và ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút.
+ Thu dịch nổi và bổ sung thể tích tương đương isopropanol (1:1), để ở nhiệt độ -20oC trong 20 phút.
+ Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, loại dịch nổi.
+ Rửa tủa 2 lần với ethanol 70% (thể tích mỗi lần là 500μl). Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút.
+ Bỏ dịch, thu cặn, làm khô. Cho 40μl H2O có bổ sung RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid tái tổ hợp trên gel agarose 1% .
- Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn: plasmid được tách chiết sau đó
được phân tích bằng enzyme giới hạnh theo hướng dẫn của nhà sản xuất.