M: Marker; 1, 2, 3, 4: sản phẩm PCR từ các dòng khuẩn lạc
Kết quả hình 3.3 cho thấy giếng 1, 2, 3, 4 xuất hiện các vạch ở vị trí khoảng 1,2 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết về kích thước gen quan tâm khi PCR. Có thể kết luận ban đầu rằng các dòng khuẩn lạc tương ứng với giếng 1, 2, 3, 4 đều mang gen quan tâm. Những dòng khuẩn lạc dương tính với phản ứng PCR được nuôi trong LB lỏng và tiến hành tách chiết plasmid để phục vụ giải trình tự.
Trình tự nucleotide của gen CHI đã tách dòng từ DNA genome thu được có kích thước 1110 nucleotitde. Bằng chương trình phân tích BLAST trong NCBI so vớ i trình tự gen CHI mang mã số NM_001317294.1 trên Ngân hàng Gen cho thấy gen CHI có 4 exon và 3 intron. Như vậy, chúng tôi đã khuếch đại, tách dòng và giải trình tự nucleotide thành công đoạn gen CHI
của 2 giống Đậu Xanh nghiên cứu.
RNA tổng số được tách chiết và tổng hợp cDNA. Tiếp theo, cDNA được sử dụng làm khuôn và cặp mồi được thiết kế dựa trên trình tự gen CHI
của Đậu Xanh đã công bố tại Ngân hàng Gen mang mã số NM_001317294.1 để khếch đại gen CHI từ 2 mẫu nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1,0% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của gen CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10
M: thang DNA 1 kb; giếng 1-ĐXĐP; giếng 2- ĐXHL10.
Kết quả nhân bản gen CHI ở hình 3.4 cho thấy băng DNA được khuếch đại có kích thước khoảng 0,7 kb, đúng như tính toán lý thuyết là kích thước củ a gen CHI. Như vâ ̣y bước đầu gen CHI đã được nhân bản thành công từ cDNA củ a hai giống Đâ ̣u Xanh ĐXĐP và ĐXHL10.
Tương tự như trường hợp khuếch đại gen CHI từ DNA genome, sản phẩm PCR khuếch đại gen CHI được tinh sạch và tách dòng trong vector
pBT. Plasmid tái tổ hơ ̣p đã đươ ̣c cắt kiểm tra bằng că ̣p enzyme giới ha ̣n NcoI và NotI (Hình 3.5).
Hình 3.5. Kết quả kiểm tra sả n phẩm cắt vector pBT-CHI bằng cặp enzyme NcoI và NotI
M: thang DNA 1 kb; giếng 1: pBT-CHI đã cắt; giếng 2: pBT-CHI chưa cắt.
Theo lý thuyết vector pBT có kích thước 2705 bp, gen CHI có kích thước 669 bp và tổng số nucleotide của vector tái tổ hơ ̣p pBT-CHI là 3374 bp. Kết quả ở hình 3.5 cho thấy, ở giếng 2 vector pBT-CHI chưa cắ t thu đươ ̣c băng điê ̣n di DNA có kích thước khoảng hơn 3,0 kb, ở giếng 1 có 2 băng điê ̣n di DNA có kích thước khoảng 2,7 kb và 0,7 kb. Băng DNA có kích thước khoảng 2,7 kb là kích thước của vector tách dòng pBT, còn băng DNA có kích thước khoảng 0,7 kb là kích thước của gen CHI. Như
vậy, kết quả điê ̣n di kiểm tra sản phẩm cắt vector tái tổ hơ ̣p pBT-CHI bởi cặp enzyme giới ha ̣n NcoI và NotI đú ng như tính toán lý thuyết. Do đó có thể kết luận rằ ng, gen CHI đã đươ ̣c nhân dòng thành công trong vector pBT ở E.coli và plasmid tái tổ hơ ̣p pBT-CHI đươ ̣c sử du ̣ng giải trình tự nucleotide củ a gen CHI.
Kết quả giải trình tự nucleotide của gen CHI thu được có đoạn mã hóa củ a gen CHI có 669 nucleotide. Bằng chương trình phân tích BLAST trong NCBI cho kết quả về đô ̣ tương đồng 99,85% so với trình tự gen CHI mang mã số NM_001317294.1 trên ngân hàng Gen. Như vâ ̣y, kết quả phân tích trên đã khẳng đi ̣nh đoạn gen phân lâ ̣p từ mRNA của hai giống đậu xanh nghiên cứu là gen CHI. Gen CHI có kích thước 669 nucleotide, mã hóa cho 222 amino acid và mã kết thúc là TAG.
3.3. Phân tích trình tự gen CHI từ các mẫu nghiên cứu
3.3.1. Kết quả so sánh trình tự gen CHI từ DNA genome và từ cDNA
Sau khi giải trình tự nucleotide đoạn gen CHI phân lập từ DNA genome và từ mRNA tổng số, chúng tôi tiến hành so sánh đặc điểm cấu trúc gen CHI được phân lập từ 2 mẫu giống Đậu Xanh nghiên cứu với nhau. Kết quả được thể hiện tại hình 3.6