Kết quả cho thấy mẫu DNA thu được có băng sáng rõ, gọn và ít bị đứt gãy. Tiếp theo chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng của DNA tổng số bằng phương pháp đo trên máy quang phổ. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Tỷ số A260/A280 và hàm lượng DNA tổng số của hai giống đậu xanh nghiên cứu
Tên giống Tỷ số A260/A280 Hàm lượng DNA (ng/µl) ĐXĐP 2,01 2892,7 ĐXHL10 1,67 969,3
Bảng 3.1 cho thấy tỷ số A260/A280 dao động trong khoảng 1,67 – 2,01 chứng tỏ rằng các mẫu DNA tách chiết có độ tinh sạch cao, ít lẫn protein có thể sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.1.2. Kết quả khuếch đại gen CHI từ cây đậu xanh
Sử dụng DNA làm khuôn để khuếch đại trình tự gen CHI bằng phản ứng PCR với cặp mồi CHI-F và CHI-R được thiết kế dựa trên trình tự gen
CHI đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế với mã số NM_001317294.1 (bảng 2.1). Chúng tôi tiến hành phản ứng PCR trong điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 56oC. Sau 30 chu kỳ phản ứng, kết quả nhân gen được kiểm tra trên gel agarose 1% cùng với DNA Marker và được thể hiện ở hình 3.2.
Hình3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại DNA của gen CHI từ hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10
M: thang DNA 1kb; giếng 1:ĐXĐP; giếng 2:ĐXHL10
Kết quả cho thấy, ở 2 mẫu nghiên cứu xuất hiện băng DNA duy nhất sáng rõ có kích thước khoảng 1,2 kb, lớn hơn đoạn trình tự mã hóa ORF (bảng 2.1). Điều đó chứng tỏ phản ứng PCR thành công, bước đầu gen CHI
có thể đã được tổng hợp thành công từ DNA genome của hai giống đậu xanh ĐXĐP và ĐXHL10 .
3.1.3. Kết quả tách dòng gen CHI từ DNA genome
Để phục vụ mục đích tách dòng gen CHI, băng DNA có kích thước khoảng 1,2 kb được cắt khỏi bản gel tiến hành tinh sạch sản phẩm PCR để quá trình biến nạp, ghép nối gen đạt hiệu quả cao nhất. Quy trình tinh sạch sản phẩm PCR được tiến hành bằng bộ kit AccuPrep PCR Purification (Bioneer). Sản phẩm thu được thường sạch dNTP thừa và protein. Các đoạn
1 kb 0,5 kb
gen được phân lập từ DNA sau khi tinh sạch xong được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng.
Tiếp theo, sản phẩm PCR nhân gen CHI sau khi tinh sạch và kiểm tra chất lượng được gắn vào vector pBT để tạo vector tái tổ hợp bằng enzyme nối T4 ligase. Đoạn DNA của gen quan tâm sẽ được nối vào giữa trình tự MCS (multiple cloning site) ở trên trình tự gen mã hóa enzyme β-galactosidase (lacZ) của vector pBT. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào chủng vi khuẩn E.
coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt. Sau đó, cấy trải vi khuẩn E. coli
DH5α đã biến nạp trên môi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh carbenicillin, cơ chất X-gal, chất cảm ứng IPTG ở 37oC trong 16 giờ.
Sau thời gian nuôi, các khuẩn lạc mọc được trên môi trường chứng tỏ chúng đều mang vector pBT, bao gồm khuẩn lạc xanh và trắng. Khuẩn lạc xanh là các khuẩn lạc mang pBT tự đóng vòng nên vẫn còn khả năng sinh tổng hợp protein β-galactosidase để phân giải cơ chất X-gal từ không màu thành màu xanh. Còn các khuẩn lạc màu trắng do mang vector pBT đã gián đoạn gen lacZ nên không thể phân giải cơ chất thành màu xanh, đây chính là dòng khuẩn lạc có thể mang vector tái tổ hợp. Lấy ngẫu nhiên các khuẩn lạc màu trắng để kiểm tra bằng phản ứng PCR. Để kiểm tra các dòng khuẩn lạc trắng có mang gen quan tâm hay không, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi nhân gen CHI. Kết quả được thể hiện ở hình 3.3.