2.1.3 .Thiết bị
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số và mRNA tổng số
Ngâm ủ hạt đậu xanh cho nảy mầm rồi gieo trên cát sạch, khi cây được 5 - 7 ngày tuổi sử dụng lá để tách DNA tổng số và tách mRNA tổng số.
* Phương pháp tách DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết theo theo Gawel và cs năm 1991 có cải tiến [15] bao gồm các bước như sau:
+ Lấy 200 mg lá non nghiền trong nitơ lỏng thành bột mịn.
+ Bổ sung 0,8 ml đệm rửa, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi. Bước này làm 2 lần.
+ Thêm 700 µl đệm tách, trộn nhẹ. Ủ ở 65o C ít nhất 1 giờ, 5 phút lắc đều 1 lần, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Thêm 600 µl Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), trộn đều 20 phút (dung máy trộn càng tốt)
+ Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút.
+ Hút 500 µl dịch trong ở pha trên sang ống Eppendorf 1,5 µl bỏ tủa.
+ Thêm 500 µl Isopropanol, trộn nhẹ, đặt lên đá chờ có tủa trắng.
+ Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, bỏ dịch, úp xuống giấy cho khô.
+ Bổ sung 300 µl cồn 70% búng nhẹ.
+ Làm khô DNA bằng cách để trong box bật quạt.
+ Hòa tan DNA trong 50 µl nước khử ion.
* Phương pháp tách chiết RNA tổng số
RNA tổng số được tách chiết bằng cách sử dụng TRIzol reagents (Invitrogen). Các dụng cụ sử dụng trong tách RNA đều được khử DEPC 0,01%. Các bước tiến hành như sau:
+ Nghiền mẫu trong nitơ lỏng bằng chày cối đã khử trùng.
+ Bổ sung 1ml TRIzol reagents, đảo đều, nhẹ nhàng trong 5 phút. + Bổ sung 500µl Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) trong nhiệt độ phòng 5 phút.
+ Ly tâm 8000v/p trong 15 phút ở 40oC.
+ Lấy 600µl dịch nổi sang Eppendorf mới loại 1,5ml.
+ Bổ sung 300µl (isopropanol) + 50µl CH3COONa (3M) đảo nhẹ để 15 phút. + Ly tâm 8000vòng/phút trong 20 phút ở 40 oC.
+ Loại bỏ dịch nổi, thu tủa.
+ Rửa RNA bằng cồn 70% (đã pha trong DEPC 0,01%). + Ly tâm 10000vòng/phút trong 10 phút. Lăp lại 2 lần. + Làm khô 5 phút trong box bật quạt.
+ Pha loãng RNA trong 40µl nước khử DEPC 0,01%, ủ trong đá, sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC để RNA tan hết.
+ Mẫu mRNA thu được bảo quản trong tủ -84 oC.