Phần 3 Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu
3.5. Nội dung nghiên cứu
3.5.1. Tình hình dịch tiêu chảy cấp ở lợn (PED) tại Thanh Hoá
- Tình hình chăn nuôi lợn tại Thanh Hoá giai đoạn từ năm 2016 đến 2019; - Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo vị trí địa lý: Đồng bằng (huyện Yên Định và Nông Cống), ven biển (huyện Hoằng Hoá và Tĩnh Gia) và trung du miền núi (huyện Như Thanh và Thạch Thành);
39
- Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo đối tượng lợn: lợn con theo mẹ, lợn cai sữa, lợn thịt, lợn nái và lợn đực giống;
- Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo mùa: Xuân – Hạ - Thu – Đông;
- Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo quy mô đàn:Gia trại: Dưới 20 lợn nái hoặc dưới 100 lợn thịt; Trại nhỏ: từ 20-50 lợn nái hoặc từ 100-250 lợn thịt; Trại lớn: trên 50 lợn nái hoặc trên 250 lợn thịt (Thông tư số 69/2000/TTLB-BNN-TCTK).
3.5.2. Một số đặc điểm bệnh lý ở lợn mắc dịch tiêu chảy cấp tại Thanh Hoá
- Xác định triệu chứng lâm sàng ở lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED); - Xác định chỉ tiêu lâm sàng ở lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED): Thân nhiệt, tần số hô hấp, tần số tim;
- Xác định bệnh tích đại thể của lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED);
- Xác định biến đổi bệnh lý vi thể ở tá tràng, không tràng, hồi tràng và kết tràng của lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED);
- Xác định một số chỉ tiêu huyết học của lợn mắc PED: các chỉ số hồng cầu; các chỉ số bạch cầu và các chỉ số sinh hóa máu.
3.5.3. Thử nghiệm biện pháp phòngtrị dịch tiêu chảy cấp ở lợn(PED)
- Phòng dịch tiêu chảy cấp ở lợn (PED) bằng phương pháp ―Gut feedback‖của Thai Swine Veternary Association (2015) để phòng bệnh.
- Điều trị thử nghiệm lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED).
3.6. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6.1. Phƣơng pháp xác định tình hình dịch tiêu chảy cấp ở lợn (PED)
3.6.1.1. Phương pháp điều tra dịch tễ học
- Áp dụng các phương pháp điều tra dịch tễ học thường quy: Lợn ở các trại được theo dõi trực tiếp và điền thông tin vào phiếu theo dõi (có mẫu phiếu kèm theo).
- Sau khi điều tra xác định đàn lợn nghi mắc PED, tiến hành chọn mỗi đàn 1-2 lợn có biểu hiện lâm sàng điển hình (tiêu chảy phân vàng xám, gầy sút nhanh, giảm ăn (bú), nằm dồn đống hoặc nằm trên bụng mẹ), sau đó tiến hành lấy mẫu phân chẩn đoán nhanh bằng Test kit PED Ag và RT-PCR để xác định
40
chính xác bệnh. Những lợn còn lại ở trong đàn nếu có những biểu hiện tương tự lợn có kết quả Test kit PED Ag và RT-PCR dương tính cũng được xác định là mắc PED.
- Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc hội chứng tiêu chảy được xác định bằng phương pháp khám lâm sàng thường quy, quan sát, ghi chép các tiêu chí như trạng thái phân, thể trạng của lợn.
- Xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết (MR) và tỷ lệ tử vong (CFR) của lợn theo công thức tiêu chuẩn của Nguyễn Như Thanh & cs. (2011).
Tỷ lệ mắc bệnh (%) = Số con mắc bệnh 100 Tổng số con theo dõi
Tỷ lệ chết (%) =
Số con chết
100 Tổng số con theo dõi
Tỷ lệ tử vong (%) = Số con chết 100 Tổng số con mắc bệnh
Tiến hành quan sát, thu thập, ghi chép, các biểu hiện của lợn trước khi mổ khám; các bệnh tích đại thể. Sau khi thu thập đầy đủ thông tin, tiến hành thống kê lại các chỉ tiêu theo dõi và phân tích, hồi cứu để đưa ra những kết quả chính xác.
3.6.1.2. Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng Test kit PED Ag
a. Nguyên lý
Test kit PED Ag dựa trên nguyên lý kỹ thuật sắc ký miễn dịch sử dụng phương pháp Direct Sandwich. Hai kháng thể đơn dòng trong thiết bị kết hợp đặc thù với các vùng quyết định kháng nguyên khác nhau của kháng nguyên cần chẩn đoán. Sau khi cho bệnh phẩm thấm vào vị trí đệm cellulose của thiết bị, các kháng nguyên của virus PED sẽ di chuyển và kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kháng thể đơn dòng kháng virus PED, để tạo thành phức hợp ―Kháng nguyên – Kháng thể‖. Sau đó, phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng kháng virus PED khác trong màng Nitơ-cellulose của thiết bị, để tạo thành phức chất kẹp hoàn chỉnh ―Kháng thể - Kháng nguyên – Kháng thể‖.
41
b. Phương pháp thực hiện
- Tất cả các thành phần có trong test bao gồm: Dung dịch pha loãng; tăm bông; dụng cụ thử cho kết quả được lấy ra và để ở nơi bằng phẳng, sạch sẽ, thoáng mát.
- Lấy mẫu phân (để thăm dò sự hiện diện của virus PED) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất của bộ kit PED-Ag test kit (Hình 3.2).
Hình 3.2. Các bước tiến hành kiểm tra mẫu bệnh bằng Test kit PED Ag
c. Đọc kết quả
- Phản ứng xảy ra khi có đường màu tím chạy dọc trên bảng kết quả (nằm ở giữa dụng cụ xét nghiệm) ngay cạnh lỗ tròn chứa dung dịch bệnh phẩm. Sau 1 phút nếu không thấy có sự di chuyển của màu tím, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch bệnh phẩm.Đọc kết quả 5-10 phút.
42
- Ở phía bên trái trong giếng kết quả, một thanh màu xuất hiện (tại chữ C), có nghĩa là các bước thực hiện phản ứng đúng cách. Kết quả dương tính khi có thêm 1 thanh màu xuất hiện bên phải (tại chữ T) trong giếng kết quả (Hình 3.3).
- Ở phía bên trái trong giếng kết quả, không có xuất hiện thanh màu nào, có nghĩa thao tác thực hiện không đúng, không thực hiện đúng hướng dẫn đã quy định. Do đó, phản ứng phải được thực hiện lại.
3.6.1.3. Phương pháp RT - PCR
Sự có mặt của virus PEDV trên những lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng PED được xác định bằng kỹ thuật RT-PCR. RNA được chiết tách bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit (hãng Qiagen), cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại một phần gen S, sản phẩm khuếch đại có độ dài 651bp (Park & cs., 2008). RNA tổng số được tách chiết bằng Kit Qiagen, các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA sau tách chiết được bảo quản ở nhiệt độ -80oC. Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng của Kit Invitrogen.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2%. Điện di ở hiệu điện thế 100V cường độ 100 mA, thời gian điện di trong 30 phút. Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Red gel trong khoảng 5 - 7 phút. Sau khi nhuộm, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi mẫu cho kích thước sản phẩm DNA theo đúng thiết kế mồi, mẫu âm tính khi không có sản phẩm DNA.
3.6.2. Phƣơng pháp mổ khám bệnh tích đại thể
Sử dụng phương pháp mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ Khoa học & Công nghệ, 2010) để tiến hành nghiên cứu tổn thương đại thể và lấy mẫu làm tiêu bản bệnh lý.
1. Kiểm tra bên ngoài: thể trạng, lông, da, các vết thương, mụn loét, các lỗ tự nhiên,… chụp ảnh trước khi mổ khám;
2. Mổ khám và kiểm tra các cơ quan bên trong. Khám lần lượt từ ngoài vào trong, từ trên xuống dưới, tránh bỏ sót các cơ quan. Ghi biên bản mổ khám và chụp ảnh các bệnh tích đại thể;
43
3. Lấy mẫu làm tiêu bản vi thể: các mẫu thu nhận tá tràng, không tràng, hồi tràng và kết tràng. Mỗi cơ quan tổ chức lấy một phần ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể.
3.6.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể
Sử dụng phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin, cắt dán mảnh bằng máy Microtom. Mỗi lợn bệnh tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc thành một block, từ mỗi block sau khi làm tiêu bản chọn ra 5 tiêu bản đẹp nhất để kiểm tra bệnh tích vi thể. Tiêu bản được để khô và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Phương pháp bao gồm các bước sau:
1. Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất: Formol 10%, dao, kéo, panh kẹp, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 370
C, máy cắt mảnh Microtom, nước ấm 48-520C, Xylen, Paraffin, thuốc nhuộm Haematoxilin, Eosin…;
2. Lấy bệnh phẩm là ruột: Tá tràng, không tràng, hồi tràng và kết tràng. 3. Cố định bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch Formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm).
4. Vùi bệnh phẩm bao gồm các bước sau:
5. Rửa Formol: lấy tổ chức ra khỏi bình Formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 - 5mm cho vào khuôn đúc bằng nhựa. Đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờ để rửa sạch Formol.
6. Chạy mẫu: đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động trong 18 tiếng. Lấy mẫu ra và tiến hành đúc block.
Bảng 3.1. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ) Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 60º 1:00 7 Cồn 100º 1:30 2 Cồn 60º 1:00 8 Cồn 100º 1:30 3 Cồn 70º 1:30 9 Xylen 1:30 4 Cồn 80º 1:30 10 Xylen 1:30 5 Cồn 96º 1:30 11 Parafin 2:00 6 Cồn 100º 1:30 12 Parafin 2:00
44 7. Đúc block:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh Paraffin lỏng vào khuôn block. Sau đó đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh 4ºC của máy làm nguội block. Để nguội đến khi block đông cứng, đặc chắc, không còn ấm là có thể tách mẫu ra khỏi khuôn.
Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với độ dày mảnh cắt khoảng 3 - 5µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát phần tổ chức.
Làm giãn mảnh cắt: dùng panh kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 - 52ºC cho mảnh cắt giãn ra hoàn toàn rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để tủ ấm 37ºC đến khi mảnh cắt khô lại.
8. Nhuộm tiêu bản: bao gồm các bước sau:
Khử Paraffin: cho tiêu bản qua hệ thống Xylen gồm 3 cốc:
Xylen I: 10 phút Xylen II: 10 phút Xylen III: 10 phút Khử Xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc: (mỗi lần 1 phút)
Cồn 100º: 2 lần Cồn 95º: 1 lần Cồn 70º: 1 lần Cồn 50º: 1 lần Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 5- 10 phút.
- Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân): lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Haematoxilin ngập tiêu bản. Để trong khoảng 3 - 5 phút sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua nước. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là được.
Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu đậm, nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 96º + HCl 1%) trong 30 giây. Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
- Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3 - 5 phút, tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước chảy 5-10 phút cho hết Eosin thừa.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn tuyệt đối, mỗi lọ 1 phút.
- Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản đi qua hai lọ Xylen, mỗi lọ 3 phút. - Gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngoài.
45
- Đánh giá kết quả: đem soi lên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, không có nước, không có bọt khí là được.
3.6.4. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
Thí nghiệm được tiến hành trên 80 con lợn ở 2 tuần tuổi. Trong đó, 40 con có triệu chứng điển hình của bệnh và sau đó được sử dụng Test kit PED Ag để sàng lọc, những mẫu dương tính được vận chuyển về phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ vắc-xin, Công ty RTD để xác định sự có mặt của virus PED bằng phương pháp RT-PCR.
Lợn thuộc đối tượng lấy máu được tách mẹ (không cho bú) từ 1 giờ sáng, đến 6 giờ sáng lấy máu. Trừ yếu tố thí nghiệm, các yếu tố khác như: giống, tuổi, giới tính, điều kiện nuôi dưỡng... có điều kiện tương đương nhau. Máu được lấy ở vịnh tĩnh mạch cổ của các lợn thí nghiệm khoảng 2ml/con đưa nhanh vào ống chống đông EDTA lắc nhẹ, bảo quản nhiệt độ 2 - 80C đưa về phòng thí nghiệm và mẫu được xét nghiệm trong vòng 4 – 8 giờ sau khi được thu thập. Ngoài ra, các lợn được sử dụng trong thí nghiệm đều được đảm bảo quyền động vật.
- Huyết tương được tách bằng máy ly tâm ở 3.000 vòng trong 10 phút. - Các mẫu máu được xác định chỉ số sinh lý máu: RBC, MCV, HCT, HGB, MCH, MCHC, WBC, NEU, LYM, MONO, EOS và BASO bằng máy phân tích huyết học Abbott Cell-Dyn 3700.
Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dòng tế bào theo kích thước tế bào, có nhân hay không có nhân, theo hình dạng nhân... đếm trên toàn bộ ống mẫu máu xét nghiệm mà không cần tách hay pha loãng mẫu.
- Tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: + Số lượng hồng cầu (RBC, 106/μL);
+ Hàm lượng huyết sắc tố ( HGB, g/l); + Tỷ khối huyết cầu (HCT, %);
+ Thể tích trung bình hồng cầu (MCV, fl);
+ Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH, pg); + Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCHC, g/l); + Số lượng bạch cầu (WBC, 103/μL) và công thức bạch cầu (%).
46 - Xác định một số chỉ số sinh hóa máu:
+ Hàm lượng đường huyết (mmol/l): Định lượng theo phương pháp Glucometer;
+ Protein huyết thanh tổng số (g/dL): Được xác định bằng khúc xạ kế Zena. Các tiểu phần protein huyết thanh (albumin, α, β, γ globulin) (%): Được xác định bằng kỹ thuật điện di trên phiến Cellulose acetate và đọc kết quả trên Denssitomester junior-24.
+ Độ dự trữ kiềm trong máu (mg%): Định lượng theo phương pháp Nevodop;
+ Hàm lượng Natri và Kali trong huyết thanh (mEq/l): Định lượng bằng máy quang phổ hấp phụ.
3.6.5. Phƣơng pháp kiểm tra tính mẫn cảm của E. coli phân lập từ phân lợn mắc bệnh tiêu chảy với một số thuốc kháng sinh
- Tiến hành làm kháng sinh đồ dựa theo nguyên lý của Kirby – Bauer: Mẫu phân lợn bệnh được pha loãng và nuôi cấy trên các môi MacConkey Agar để phân lập và giám định vi khuẩn E. coli, tiến hành bắt các khuẩn lạc thuần khiết nuôi cấy trong môi trường nước thịt ở 370
C, sau 18-24 giờ lấy huyễn dịch tráng lên mặt thạch trong đĩa Petri. Sau 15 phút đặt các đĩa kháng sinh lên trên và ủ ấm 370C. Sau 16 – 18 giờ đo đường kính các vòng vô khuẩn.
- Đánh giá dựa trên đường kính vòng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (2007): Mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I), hay kháng (R). Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập lại.
- Giấy tẩm kháng sinh do hãng Oxiod của Anh sản xuất.
Bảng 3.2. Đánh giá đƣờng kính vòng vô khuẩn theo hãng Oxiod TT Tên kháng sinh Kí hiệu
mã hoá Lƣợng kháng sinh (µg) Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm) R (≤) I H(≥) 1 Amoxicillin AM 20/10 13 14-17 18 2 Colistin sulphate CL 10 8 9-10 11 3 Enrofloxacin ENR 20 16 17-19 20 4 Gentamycin GM 10 12 13-14 15 5 Kanamycin K 30 13 14-17 18 6 Neomycin N 30 12 13-16 17 7 Norfloxacin NOR 10 12 13-16 17 8 Streptomycin STR 23,75/1,25 10 11-15 16 9 Tetracyclin TE 30 14 15-18 19
47
3.6.6. Phƣơng pháp chế chế phẩm “Gut feedback”
Các bước tạo chế phẩm ―Gut feedback‖ PED gồm:
Hình 3.4. Các bước chế và sử dụng chế phẩm “Gut feedback”
- Bước 1: Lấy một bộ ruột (cả ruột non và ruột già) của lợn con dưới 1