Phần 5 Kết luận và kiến nghị
3.2. Các bước tiến hành kiểm tra mẫu bệnh bằng Test kit PED Ag
c. Đọc kết quả
- Phản ứng xảy ra khi có đường màu tím chạy dọc trên bảng kết quả (nằm ở giữa dụng cụ xét nghiệm) ngay cạnh lỗ tròn chứa dung dịch bệnh phẩm. Sau 1 phút nếu khơng thấy có sự di chuyển của màu tím, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch bệnh phẩm.Đọc kết quả 5-10 phút.
42
- Ở phía bên trái trong giếng kết quả, một thanh màu xuất hiện (tại chữ C), có nghĩa là các bước thực hiện phản ứng đúng cách. Kết quả dương tính khi có thêm 1 thanh màu xuất hiện bên phải (tại chữ T) trong giếng kết quả (Hình 3.3).
- Ở phía bên trái trong giếng kết quả, khơng có xuất hiện thanh màu nào, có nghĩa thao tác thực hiện khơng đúng, không thực hiện đúng hướng dẫn đã quy định. Do đó, phản ứng phải được thực hiện lại.
3.6.1.3. Phương pháp RT - PCR
Sự có mặt của virus PEDV trên những lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng PED được xác định bằng kỹ thuật RT-PCR. RNA được chiết tách bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit (hãng Qiagen), cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại một phần gen S, sản phẩm khuếch đại có độ dài 651bp (Park & cs., 2008). RNA tổng số được tách chiết bằng Kit Qiagen, các bước tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA sau tách chiết được bảo quản ở nhiệt độ -80oC. Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng của Kit Invitrogen.
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1,2%. Điện di ở hiệu điện thế 100V cường độ 100 mA, thời gian điện di trong 30 phút. Kết thúc điện di, bản gel được lấy ra nhuộm Red gel trong khoảng 5 - 7 phút. Sau khi nhuộm, bản gel được chuyển vào máy phát tia UV để quan sát kết quả điện di. Vị trí các đoạn DNA được phát hiện bằng những vệt sáng tương ứng của thuốc nhuộm, chụp ảnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi mẫu cho kích thước sản phẩm DNA theo đúng thiết kế mồi, mẫu âm tính khi khơng có sản phẩm DNA.
3.6.2. Phƣơng pháp mổ khám bệnh tích đại thể
Sử dụng phương pháp mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ Khoa học & Công nghệ, 2010) để tiến hành nghiên cứu tổn thương đại thể và lấy mẫu làm tiêu bản bệnh lý.
1. Kiểm tra bên ngồi: thể trạng, lơng, da, các vết thương, mụn loét, các lỗ tự nhiên,… chụp ảnh trước khi mổ khám;
2. Mổ khám và kiểm tra các cơ quan bên trong. Khám lần lượt từ ngồi vào trong, từ trên xuống dưới, tránh bỏ sót các cơ quan. Ghi biên bản mổ khám và chụp ảnh các bệnh tích đại thể;
43
3. Lấy mẫu làm tiêu bản vi thể: các mẫu thu nhận tá tràng, không tràng, hồi tràng và kết tràng. Mỗi cơ quan tổ chức lấy một phần ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể.
3.6.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể
Sử dụng phương pháp làm tiêu bản vi thể tẩm đúc bằng paraffin, cắt dán mảnh bằng máy Microtom. Mỗi lợn bệnh tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc thành một block, từ mỗi block sau khi làm tiêu bản chọn ra 5 tiêu bản đẹp nhất để kiểm tra bệnh tích vi thể. Tiêu bản được để khơ và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Phương pháp bao gồm các bước sau:
1. Chuẩn bị dụng cụ và hoá chất: Formol 10%, dao, kéo, panh kẹp, phiến kính, máy đúc block, khn đúc, tủ ấm 370
C, máy cắt mảnh Microtom, nước ấm 48-520C, Xylen, Paraffin, thuốc nhuộm Haematoxilin, Eosin…;
2. Lấy bệnh phẩm là ruột: Tá tràng, không tràng, hồi tràng và kết tràng. 3. Cố định bệnh phẩm: ngâm miếng tổ chức vào dung dịch Formol 10% (chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm).
4. Vùi bệnh phẩm bao gồm các bước sau:
5. Rửa Formol: lấy tổ chức ra khỏi bình Formol 10%, cắt thành các miếng có chiều dài, rộng khoảng 4 - 5mm cho vào khuôn đúc bằng nhựa. Đem rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24 giờ để rửa sạch Formol.
6. Chạy mẫu: đưa mẫu vào hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động trong 18 tiếng. Lấy mẫu ra và tiến hành đúc block.
Bảng 3.1. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ) Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 60º 1:00 7 Cồn 100º 1:30 2 Cồn 60º 1:00 8 Cồn 100º 1:30 3 Cồn 70º 1:30 9 Xylen 1:30 4 Cồn 80º 1:30 10 Xylen 1:30 5 Cồn 96º 1:30 11 Parafin 2:00 6 Cồn 100º 1:30 12 Parafin 2:00
44 7. Đúc block:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chính giữa khn block, đổ nhanh Paraffin lỏng vào khn block. Sau đó đặt khn đã đúc sang bàn lạnh 4ºC của máy làm nguội block. Để nguội đến khi block đơng cứng, đặc chắc, khơng cịn ấm là có thể tách mẫu ra khỏi khn.
Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với độ dày mảnh cắt khoảng 3 - 5µm, sao cho mảnh cắt khơng rách, nát phần tổ chức.
Làm giãn mảnh cắt: dùng panh kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 - 52ºC cho mảnh cắt giãn ra hoàn toàn rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để tủ ấm 37ºC đến khi mảnh cắt khô lại.
8. Nhuộm tiêu bản: bao gồm các bước sau:
Khử Paraffin: cho tiêu bản qua hệ thống Xylen gồm 3 cốc:
Xylen I: 10 phút Xylen II: 10 phút Xylen III: 10 phút Khử Xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc: (mỗi lần 1 phút)
Cồn 100º: 2 lần Cồn 95º: 1 lần Cồn 70º: 1 lần Cồn 50º: 1 lần Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 5- 10 phút.
- Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân): lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Haematoxilin ngập tiêu bản. Để trong khoảng 3 - 5 phút sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua nước. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là được.
Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu đậm, nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 96º + HCl 1%) trong 30 giây. Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
- Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3 - 5 phút, tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước chảy 5-10 phút cho hết Eosin thừa.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn tuyệt đối, mỗi lọ 1 phút.
- Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản đi qua hai lọ Xylen, mỗi lọ 3 phút. - Gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngồi.
45
- Đánh giá kết quả: đem soi lên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, khơng có nước, khơng có bọt khí là được.
3.6.4. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
Thí nghiệm được tiến hành trên 80 con lợn ở 2 tuần tuổi. Trong đó, 40 con có triệu chứng điển hình của bệnh và sau đó được sử dụng Test kit PED Ag để sàng lọc, những mẫu dương tính được vận chuyển về phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ vắc-xin, Cơng ty RTD để xác định sự có mặt của virus PED bằng phương pháp RT-PCR.
Lợn thuộc đối tượng lấy máu được tách mẹ (không cho bú) từ 1 giờ sáng, đến 6 giờ sáng lấy máu. Trừ yếu tố thí nghiệm, các yếu tố khác như: giống, tuổi, giới tính, điều kiện ni dưỡng... có điều kiện tương đương nhau. Máu được lấy ở vịnh tĩnh mạch cổ của các lợn thí nghiệm khoảng 2ml/con đưa nhanh vào ống chống đông EDTA lắc nhẹ, bảo quản nhiệt độ 2 - 80C đưa về phịng thí nghiệm và mẫu được xét nghiệm trong vòng 4 – 8 giờ sau khi được thu thập. Ngoài ra, các lợn được sử dụng trong thí nghiệm đều được đảm bảo quyền động vật.
- Huyết tương được tách bằng máy ly tâm ở 3.000 vòng trong 10 phút. - Các mẫu máu được xác định chỉ số sinh lý máu: RBC, MCV, HCT, HGB, MCH, MCHC, WBC, NEU, LYM, MONO, EOS và BASO bằng máy phân tích huyết học Abbott Cell-Dyn 3700.
Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dịng tế bào theo kích thước tế bào, có nhân hay khơng có nhân, theo hình dạng nhân... đếm trên toàn bộ ống mẫu máu xét nghiệm mà khơng cần tách hay pha lỗng mẫu.
- Tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: + Số lượng hồng cầu (RBC, 106/μL);
+ Hàm lượng huyết sắc tố ( HGB, g/l); + Tỷ khối huyết cầu (HCT, %);
+ Thể tích trung bình hồng cầu (MCV, fl);
+ Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH, pg); + Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCHC, g/l); + Số lượng bạch cầu (WBC, 103/μL) và công thức bạch cầu (%).
46 - Xác định một số chỉ số sinh hóa máu:
+ Hàm lượng đường huyết (mmol/l): Định lượng theo phương pháp Glucometer;
+ Protein huyết thanh tổng số (g/dL): Được xác định bằng khúc xạ kế Zena. Các tiểu phần protein huyết thanh (albumin, α, β, γ globulin) (%): Được xác định bằng kỹ thuật điện di trên phiến Cellulose acetate và đọc kết quả trên Denssitomester junior-24.
+ Độ dự trữ kiềm trong máu (mg%): Định lượng theo phương pháp Nevodop;
+ Hàm lượng Natri và Kali trong huyết thanh (mEq/l): Định lượng bằng máy quang phổ hấp phụ.
3.6.5. Phƣơng pháp kiểm tra tính mẫn cảm của E. coli phân lập từ phân lợn mắc bệnh tiêu chảy với một số thuốc kháng sinh
- Tiến hành làm kháng sinh đồ dựa theo nguyên lý của Kirby – Bauer: Mẫu phân lợn bệnh được pha lỗng và ni cấy trên các môi MacConkey Agar để phân lập và giám định vi khuẩn E. coli, tiến hành bắt các khuẩn lạc
thuần khiết nuôi cấy trong môi trường nước thịt ở 370
C, sau 18-24 giờ lấy huyễn dịch tráng lên mặt thạch trong đĩa Petri. Sau 15 phút đặt các đĩa kháng sinh lên trên và ủ ấm 370C. Sau 16 – 18 giờ đo đường kính các vịng vơ khuẩn.
- Đánh giá dựa trên đường kính vịng vơ khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (2007): Mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I), hay kháng (R). Nếu khuẩn lạc mọc trong vịng ức chế rõ ràng thì phải ni cấy, phân lập lại.
- Giấy tẩm kháng sinh do hãng Oxiod của Anh sản xuất.
Bảng 3.2. Đánh giá đƣờng kính vịng vơ khuẩn theo hãng Oxiod TT Tên kháng sinh Kí hiệu
mã hố Lƣợng kháng sinh (µg) Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) R (≤) I H(≥) 1 Amoxicillin AM 20/10 13 14-17 18 2 Colistin sulphate CL 10 8 9-10 11 3 Enrofloxacin ENR 20 16 17-19 20 4 Gentamycin GM 10 12 13-14 15 5 Kanamycin K 30 13 14-17 18 6 Neomycin N 30 12 13-16 17 7 Norfloxacin NOR 10 12 13-16 17 8 Streptomycin STR 23,75/1,25 10 11-15 16 9 Tetracyclin TE 30 14 15-18 19
47
3.6.6. Phƣơng pháp chế chế phẩm “Gut feedback”
Các bước tạo chế phẩm ―Gut feedback‖ PED gồm:
Hình 3.4. Các bước chế và sử dụng chế phẩm “Gut feedback”
- Bước 1: Lấy một bộ ruột (cả ruột non và ruột già) của lợn con dưới 1 tuần tuổi mới xuất hiện triệu chứng tiêu chảy phân vàng, có kết quả dương tính với Test kit PED Ag và RT-PCR đem xay nhuyễn. Những ruột bị căng phồng, thành mỏng và trong suốt không đạt yêu cầu (Pospischil & cs. (1981), PEDV nhân lên trong bào tương của các tế bào lông nhung, phá huỷ các tế bào biểu mô và làm ngắn lơng nhung niêm mạc ruột. Vì vậy, những ruột bị căng phồng, thành mỏng và trong suốt sẽ có số lượng virus thấp).
- Bước 2: Cho dung dịch nước muối sinh lý 0,9% vào với tỷ lệ 1/5 (1 phần ruột, 5 phần nước muối sinh lý 0,9%) để được chế phẩm.
- Bước 3: Cho Amoxicillin và Colistin 10% liều 300 ppm (để tiêu diệt các vi khuẩn), tiếp tục xay (lắc) 1 - 2 phút sẽ được chế phẩm ―gut feedback‖ PED.
- Bước 4: Đổ chế phẩm ra dụng cụ vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ 2-80C.
3.6.7. Quy trình sử dụng chế phẩm “Gut feedback” phịng dịch tiêu chảy cấp
- Thí nghiệm được thực hiện trên 60 lợn nái mang thai ở tuần thứ 13 âm tính với PED. Cụ thể như sau:
Vật tƣ Liều lƣợng Cách dùng
Chế phẩm
―Gut feedback‖ 15ml/lần
- Trộn 15ml chế phẩm ―gut feedback‖ PED với 50g thức ăn và cho ăn trước bữa ăn để lợn ăn hết. - Dùng đến khi lợn nái có biểu hiện tiêu chảy, sau 7 ngày khơng tiêu chảy thì dừng.
48
3.6.8. Xác định kháng thể PED trong huyết thanh sau khi sử dụng chế phẩm “Gut feedback” “Gut feedback”
Lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn nái sau khi sử dụng chế phẩm ―Gut feedback‖ PED 14 và 21 ngày để kiểm tra kháng thể trong huyết thanh. Lấy máu vào sáng sớm trước khi cho ăn. Dùng xilanh 5ml, lấy 3ml máu vào xilanh và lấy 1ml khơng khí sau đó để nghiêng xilanh góc 450
và n tĩnh cho máu đơng. Bảo quản nhiệt độ 2-80C đưa về phịng thí nghiệm trong thời gian nhanh nhất, không được để quá 2 ngày.
Sử dụng phương pháp test ELISA theo ISO/IEC 17025:2005 để xác định kháng thể trong huyết thanh lợn nái đã được dùng ―gut feedback‖ PED. Kết quả kháng thể là chỉ số OD, nếu OD ≥ Cut off: Dương tính. Cut off có giá trị = 0,21.
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Các bước tiến hành được mơ tả tại Hình 3.5.
Hình 3.5. Các bước tiến hành xác định kháng thể bằng test ELISA
49
3.6.9. Điều trị thử nghiệm lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED)
Tiến hành xây dựng hai phác đồ điều trị trên đàn lợn mắc PED ở 2 tuần tuổi, mỗi phác đồ điều trị 50 con. Cụ thể như sau:
Phác đồ Thuốc Liều lƣợng Đƣờng đƣa thuốc Phác đồ 1 - Colistin sulfat - Atropin sulfat - Lactat Ringer - Glucose 5% 100.000UI/kgTT/lần (ngày 2 lần) 0,1mg/kgTT/ngày 20ml/con/lần (buổi sáng) 20ml/con/lần (buổi chiều)
Uống Tiêm bắp Tiêm phúc mạc Tiêm phúc mạc Phác đồ 2 - Colistin sulfat - Atropin sulfat - Lactat Ringer - Glucose 5% - Máu lợn 100.000UI/kgTT/lần (ngày 2 lần) 0,1mg/kgTT/ngày 20ml/con/lần (buổi sáng) 20ml/con/lần (buổi chiều) 2ml/con/lần/2ngày Uống Tiêm bắp Tiêm phúc mạc Tiêm phúc mạc Tiêm bắp
Máu lợn được lấy trực tiếp 2ml từ những lợn sử dụng trong phác đồ 2 + 0,2ml Citrat natri để chống đông.
Kết quả điều trị được theo dõi thông qua các chỉ tiêu:
Tỷ lệ khỏi bệnh (%) = Số con khỏi bệnh 100 Tổng số con điều trị Tỷ lệ chết (%) = Số con chết 100 Tổng số con điều trị Tỷ lệ tái phát (%) = Số con tái phát 100 Tổng số con điều trị khỏi
Thời gian điều trị trung bình/ca (ngày) =
Tổng số ngày điều trị Tổng số con điều trị
Lượng thuốc điều trị =
Tổng lượng thuốc sử dụng Tổng số con điều trị
50
3.6.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Dung lượng mẫu khảo sát được xác định theo Thrusfield (1997):
n =
1,962 x Pexp (1- Pexp) d2
Trong đó: Chọn độ tin cậy 95% và độ chính xác tuyệt đối mong muốn d = 0,05. - Số liệu thơ được xử lý và tính tốn trên Excel, số liệu tổng hợp được xử lý bằng chương trình thống kê T.Test (so sánh 2 giá trị trung bình) và Chitest (so sánh 2 tỷ lệ phần trăm). Phép thử chi bình phương (χ2: Chi-square) được sử dụng để phân tích cho trường hợp dung mẫu lớn (với giá trị mong đợi theo lý thuyết