Phần 5 Kết luận và kiến nghị
3.1. Hệ thống máy chuyển đúc mẫu tự động gồm 12 bình
Bình Hóa chất Thời gian (giờ) Bình Hóa chất Thời gian (giờ)
1 Cồn 60º 1:00 7 Cồn 100º 1:30 2 Cồn 60º 1:00 8 Cồn 100º 1:30 3 Cồn 70º 1:30 9 Xylen 1:30 4 Cồn 80º 1:30 10 Xylen 1:30 5 Cồn 96º 1:30 11 Parafin 2:00 6 Cồn 100º 1:30 12 Parafin 2:00
44 7. Đúc block:
Đặt miếng bệnh phẩm nằm vào chính giữa khn block, đổ nhanh Paraffin lỏng vào khn block. Sau đó đặt khn đã đúc sang bàn lạnh 4ºC của máy làm nguội block. Để nguội đến khi block đơng cứng, đặc chắc, khơng cịn ấm là có thể tách mẫu ra khỏi khn.
Cắt mảnh: cắt bằng máy microtom với độ dày mảnh cắt khoảng 3 - 5µm, sao cho mảnh cắt khơng rách, nát phần tổ chức.
Làm giãn mảnh cắt: dùng panh kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 - 52ºC cho mảnh cắt giãn ra hoàn toàn rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để tủ ấm 37ºC đến khi mảnh cắt khô lại.
8. Nhuộm tiêu bản: bao gồm các bước sau:
Khử Paraffin: cho tiêu bản qua hệ thống Xylen gồm 3 cốc:
Xylen I: 10 phút Xylen II: 10 phút Xylen III: 10 phút Khử Xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 4 cốc: (mỗi lần 1 phút)
Cồn 100º: 2 lần Cồn 95º: 1 lần Cồn 70º: 1 lần Cồn 50º: 1 lần Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 5- 10 phút.
- Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân): lau khô nước ở tiêu bản, nhỏ Haematoxilin ngập tiêu bản. Để trong khoảng 3 - 5 phút sau đó đổ thuốc nhuộm đi, rửa qua nước. Lau sạch nước xung quanh tiêu bản. Kiểm tra màu sắc, nếu thấy tiêu bản xanh tím là được.
Nếu nhạt màu, nhúng tiêu bản qua NaHCO3 1% (30 giây).
Nếu đậm, nhúng tiêu bản vào lọ cồn axit (cồn 96º + HCl 1%) trong 30 giây. Rửa sạch tiêu bản bằng nước cất.
- Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ Eosin ngập tiêu bản khoảng 3 - 5 phút, tuỳ theo thực tế màu Eosin. Sau đó rửa nước chảy 5-10 phút cho hết Eosin thừa.
Cho tiêu bản qua hai lọ cồn tuyệt đối, mỗi lọ 1 phút.
- Tẩy cồn, làm trong tiêu bản: cho tiêu bản đi qua hai lọ Xylen, mỗi lọ 3 phút. - Gắn Baume canada: nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn Xylen trên tiêu bản. Ấn nhẹ để dồn hết bọt khí ra ngồi.
45
- Đánh giá kết quả: đem soi lên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy nhân bắt màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng, khơng có nước, khơng có bọt khí là được.
3.6.4. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
Thí nghiệm được tiến hành trên 80 con lợn ở 2 tuần tuổi. Trong đó, 40 con có triệu chứng điển hình của bệnh và sau đó được sử dụng Test kit PED Ag để sàng lọc, những mẫu dương tính được vận chuyển về phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ vắc-xin, Cơng ty RTD để xác định sự có mặt của virus PED bằng phương pháp RT-PCR.
Lợn thuộc đối tượng lấy máu được tách mẹ (không cho bú) từ 1 giờ sáng, đến 6 giờ sáng lấy máu. Trừ yếu tố thí nghiệm, các yếu tố khác như: giống, tuổi, giới tính, điều kiện ni dưỡng... có điều kiện tương đương nhau. Máu được lấy ở vịnh tĩnh mạch cổ của các lợn thí nghiệm khoảng 2ml/con đưa nhanh vào ống chống đông EDTA lắc nhẹ, bảo quản nhiệt độ 2 - 80C đưa về phịng thí nghiệm và mẫu được xét nghiệm trong vòng 4 – 8 giờ sau khi được thu thập. Ngoài ra, các lợn được sử dụng trong thí nghiệm đều được đảm bảo quyền động vật.
- Huyết tương được tách bằng máy ly tâm ở 3.000 vòng trong 10 phút. - Các mẫu máu được xác định chỉ số sinh lý máu: RBC, MCV, HCT, HGB, MCH, MCHC, WBC, NEU, LYM, MONO, EOS và BASO bằng máy phân tích huyết học Abbott Cell-Dyn 3700.
Nguyên lý: Máy sẽ tách riêng các dịng tế bào theo kích thước tế bào, có nhân hay khơng có nhân, theo hình dạng nhân... đếm trên toàn bộ ống mẫu máu xét nghiệm mà khơng cần tách hay pha lỗng mẫu.
- Tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học như sau: + Số lượng hồng cầu (RBC, 106/μL);
+ Hàm lượng huyết sắc tố ( HGB, g/l); + Tỷ khối huyết cầu (HCT, %);
+ Thể tích trung bình hồng cầu (MCV, fl);
+ Lượng huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCH, pg); + Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu (MCHC, g/l); + Số lượng bạch cầu (WBC, 103/μL) và công thức bạch cầu (%).
46 - Xác định một số chỉ số sinh hóa máu:
+ Hàm lượng đường huyết (mmol/l): Định lượng theo phương pháp Glucometer;
+ Protein huyết thanh tổng số (g/dL): Được xác định bằng khúc xạ kế Zena. Các tiểu phần protein huyết thanh (albumin, α, β, γ globulin) (%): Được xác định bằng kỹ thuật điện di trên phiến Cellulose acetate và đọc kết quả trên Denssitomester junior-24.
+ Độ dự trữ kiềm trong máu (mg%): Định lượng theo phương pháp Nevodop;
+ Hàm lượng Natri và Kali trong huyết thanh (mEq/l): Định lượng bằng máy quang phổ hấp phụ.
3.6.5. Phƣơng pháp kiểm tra tính mẫn cảm của E. coli phân lập từ phân lợn mắc bệnh tiêu chảy với một số thuốc kháng sinh
- Tiến hành làm kháng sinh đồ dựa theo nguyên lý của Kirby – Bauer: Mẫu phân lợn bệnh được pha lỗng và ni cấy trên các môi MacConkey Agar để phân lập và giám định vi khuẩn E. coli, tiến hành bắt các khuẩn lạc
thuần khiết nuôi cấy trong môi trường nước thịt ở 370
C, sau 18-24 giờ lấy huyễn dịch tráng lên mặt thạch trong đĩa Petri. Sau 15 phút đặt các đĩa kháng sinh lên trên và ủ ấm 370C. Sau 16 – 18 giờ đo đường kính các vịng vơ khuẩn.
- Đánh giá dựa trên đường kính vịng vô khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and Laboratory Standards Institute (2007): Mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I), hay kháng (R). Nếu khuẩn lạc mọc trong vịng ức chế rõ ràng thì phải ni cấy, phân lập lại.
- Giấy tẩm kháng sinh do hãng Oxiod của Anh sản xuất.
Bảng 3.2. Đánh giá đƣờng kính vịng vơ khuẩn theo hãng Oxiod TT Tên kháng sinh Kí hiệu
mã hố Lƣợng kháng sinh (µg) Đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) R (≤) I H(≥) 1 Amoxicillin AM 20/10 13 14-17 18 2 Colistin sulphate CL 10 8 9-10 11 3 Enrofloxacin ENR 20 16 17-19 20 4 Gentamycin GM 10 12 13-14 15 5 Kanamycin K 30 13 14-17 18 6 Neomycin N 30 12 13-16 17 7 Norfloxacin NOR 10 12 13-16 17 8 Streptomycin STR 23,75/1,25 10 11-15 16 9 Tetracyclin TE 30 14 15-18 19
47
3.6.6. Phƣơng pháp chế chế phẩm “Gut feedback”
Các bước tạo chế phẩm ―Gut feedback‖ PED gồm:
Hình 3.4. Các bước chế và sử dụng chế phẩm “Gut feedback”
- Bước 1: Lấy một bộ ruột (cả ruột non và ruột già) của lợn con dưới 1 tuần tuổi mới xuất hiện triệu chứng tiêu chảy phân vàng, có kết quả dương tính với Test kit PED Ag và RT-PCR đem xay nhuyễn. Những ruột bị căng phồng, thành mỏng và trong suốt không đạt yêu cầu (Pospischil & cs. (1981), PEDV nhân lên trong bào tương của các tế bào lông nhung, phá huỷ các tế bào biểu mô và làm ngắn lơng nhung niêm mạc ruột. Vì vậy, những ruột bị căng phồng, thành mỏng và trong suốt sẽ có số lượng virus thấp).
- Bước 2: Cho dung dịch nước muối sinh lý 0,9% vào với tỷ lệ 1/5 (1 phần ruột, 5 phần nước muối sinh lý 0,9%) để được chế phẩm.
- Bước 3: Cho Amoxicillin và Colistin 10% liều 300 ppm (để tiêu diệt các vi khuẩn), tiếp tục xay (lắc) 1 - 2 phút sẽ được chế phẩm ―gut feedback‖ PED.
- Bước 4: Đổ chế phẩm ra dụng cụ vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ 2-80C.
3.6.7. Quy trình sử dụng chế phẩm “Gut feedback” phịng dịch tiêu chảy cấp
- Thí nghiệm được thực hiện trên 60 lợn nái mang thai ở tuần thứ 13 âm tính với PED. Cụ thể như sau:
Vật tƣ Liều lƣợng Cách dùng
Chế phẩm
―Gut feedback‖ 15ml/lần
- Trộn 15ml chế phẩm ―gut feedback‖ PED với 50g thức ăn và cho ăn trước bữa ăn để lợn ăn hết. - Dùng đến khi lợn nái có biểu hiện tiêu chảy, sau 7 ngày khơng tiêu chảy thì dừng.
48
3.6.8. Xác định kháng thể PED trong huyết thanh sau khi sử dụng chế phẩm “Gut feedback” “Gut feedback”
Lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của lợn nái sau khi sử dụng chế phẩm ―Gut feedback‖ PED 14 và 21 ngày để kiểm tra kháng thể trong huyết thanh. Lấy máu vào sáng sớm trước khi cho ăn. Dùng xilanh 5ml, lấy 3ml máu vào xilanh và lấy 1ml khơng khí sau đó để nghiêng xilanh góc 450
và yên tĩnh cho máu đông. Bảo quản nhiệt độ 2-80C đưa về phịng thí nghiệm trong thời gian nhanh nhất, không được để quá 2 ngày.
Sử dụng phương pháp test ELISA theo ISO/IEC 17025:2005 để xác định kháng thể trong huyết thanh lợn nái đã được dùng ―gut feedback‖ PED. Kết quả kháng thể là chỉ số OD, nếu OD ≥ Cut off: Dương tính. Cut off có giá trị = 0,21.
Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Các bước tiến hành được mô tả tại Hình 3.5.
Hình 3.5. Các bước tiến hành xác định kháng thể bằng test ELISA
49
3.6.9. Điều trị thử nghiệm lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED)
Tiến hành xây dựng hai phác đồ điều trị trên đàn lợn mắc PED ở 2 tuần tuổi, mỗi phác đồ điều trị 50 con. Cụ thể như sau:
Phác đồ Thuốc Liều lƣợng Đƣờng đƣa thuốc Phác đồ 1 - Colistin sulfat - Atropin sulfat - Lactat Ringer - Glucose 5% 100.000UI/kgTT/lần (ngày 2 lần) 0,1mg/kgTT/ngày 20ml/con/lần (buổi sáng) 20ml/con/lần (buổi chiều)
Uống Tiêm bắp Tiêm phúc mạc Tiêm phúc mạc Phác đồ 2 - Colistin sulfat - Atropin sulfat - Lactat Ringer - Glucose 5% - Máu lợn 100.000UI/kgTT/lần (ngày 2 lần) 0,1mg/kgTT/ngày 20ml/con/lần (buổi sáng) 20ml/con/lần (buổi chiều) 2ml/con/lần/2ngày Uống Tiêm bắp Tiêm phúc mạc Tiêm phúc mạc Tiêm bắp
Máu lợn được lấy trực tiếp 2ml từ những lợn sử dụng trong phác đồ 2 + 0,2ml Citrat natri để chống đông.
Kết quả điều trị được theo dõi thông qua các chỉ tiêu:
Tỷ lệ khỏi bệnh (%) = Số con khỏi bệnh 100 Tổng số con điều trị Tỷ lệ chết (%) = Số con chết 100 Tổng số con điều trị Tỷ lệ tái phát (%) = Số con tái phát 100 Tổng số con điều trị khỏi
Thời gian điều trị trung bình/ca (ngày) =
Tổng số ngày điều trị Tổng số con điều trị
Lượng thuốc điều trị =
Tổng lượng thuốc sử dụng Tổng số con điều trị
50
3.6.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu
- Dung lượng mẫu khảo sát được xác định theo Thrusfield (1997):
n =
1,962 x Pexp (1- Pexp) d2
Trong đó: Chọn độ tin cậy 95% và độ chính xác tuyệt đối mong muốn d = 0,05. - Số liệu thơ được xử lý và tính tốn trên Excel, số liệu tổng hợp được xử lý bằng chương trình thống kê T.Test (so sánh 2 giá trị trung bình) và Chitest (so sánh 2 tỷ lệ phần trăm). Phép thử chi bình phương (χ2: Chi-square) được sử dụng để phân tích cho trường hợp dung mẫu lớn (với giá trị mong đợi theo lý thuyết lớn hơn 5). Vào menu Analyze - Descriptive Statistics – Crosstabs - đưa hai biến vào hai ơ tương ứng. Sau đó nhấn vào nút Statistics, chọn Chi-square để thực hiện kiểm định. Kết quả, nếu giá trị Chi-square (ở bậc tự do df là 2) sig. > 5% thì hai biến này độc lập với nhau.
51
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH DỊCH TIÊU CHẢY CẤP Ở LỢN (PED) TẠI THANH HỐ 4.1.1. Tình hình chăn ni lợn tại Thanh Hoá giai đoạn từ năm 2016 đến 4.1.1. Tình hình chăn ni lợn tại Thanh Hoá giai đoạn từ năm 2016 đến 2019
Để khái qt về tình hình chăn ni lợn trên địa bàn tỉnh Thanh Hoá trong các năm gần đây, chúng tôi đã tổng hợp số liệu của Cục thống kê tỉnh Thanh Hoá từ năm 2016, 2017, 2018 và 2019. Kết quả được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tình hình chăn ni lợn tại Thanh Hoá giai đoạn 2016 - 2019 Năm Tổng đàn Nông hộ Tỷ lệ % Gia trại Tỷ lệ % Trang trại Tỷ lệ % 2016 945.300 652.919 69,07 124.401 13,16 167.980 17,77 2017 785.120 500.750 63,78 132.685 16,90 151.764 19,33 2018 813.789 520.255 63,93 113.524 13,95 180.010 22,12 2019 795.071 490.479 61,69 111.866 14,07 192.725 24,24
Nguồn: Cục Thống kê Thanh Hoá (2019)
Qua bảng số liệu 4.1 cho thấy tình hình chăn ni lợn ở Thanh Hố năm 2017 giảm so với năm 2016 là 160.180 con (16,94%). Theo báo cáo của Cục Quản lý giá thuộc Bộ Tài chính (2017), so với cùng kỳ năm 2016, giá thịt lợn hơi ở các tỉnh miền Bắc thấp hơn 48 – 52% (giá lợn ở mức 20.000 - 25.000đ/kg), trong khi giá thức ăn chăn nuôi công nghiệp vẫn giữ ở mức cao (12.000- 13.000đ/kg), giá trị thu được khơng đủ chi phí bù đắp cho đầu tư nên người chăn nuôi đã giảm đàn. Tuy nhiên, đến tháng 12/2017 giá lợn ổn định dần, giá thịt lợn hơi miền Bắc phổ biến trong khoảng 29.000 – 33.000 đồng/kg, miền Nam là 27.000 – 33.000 đồng/kg và sang năm 2018, giá lợn dao động từ 32.000đ/kg đến 52.000đ/kg nên người nuôi đã tái đàn trở lại nên số lợn của tỉnh Thanh Hoá đã tăng lên so với năm 2017 khoảng 3,65%.
Những tháng đầu năm 2019, giá lợn hơi ổn định ở mức cao nên người chăn nuôi đã tiếp tục tái đàn. Tuy nhiên, đến ngày 24/02/2019 bệnh Dịch tả lợn Châu Phi đã xuất hiện tại Thanh Hoá đã làm cho tổng đàn lợn của tỉnh năm 2019 giảm 18.718 con (2,30%) so với năm 2018, mặc dù giá lợn hơi ở mức cao, dao động từ 45.000đ/kg đến 85.000đ/kg (Bộ Nông nghiệp & PTNT, 2019).
52
Hình 4.1. Thực trạng các phương thức chăn ni lợn ở Thanh Hoá
Nguồn: Cục Thống kê Thanh Hố (2020)
Tuy nhiên, Hình 4.1 lại cho thấy thực trạng phương thức chăn nuôi lợn ở Thanh Hoá đang đi đúng xu thế của ngành chăn ni nói chung và các chủ trương, Nghị quyết của tỉnh Thanh Hố nói riêng đó là tỷ lệ phương thức chăn ni tập trung (gia trại và trang trại) tăng dần và ngược lại phương thức chăn nuôi nhỏ lẻ (nơng hộ) có xu hướng giảm dần. Theo Quyết định số 4833/2014/QĐ-UBND về việc phê duyệt Quy hoạch tổng thể phát triển Nông nghiệp tỉnh Thanh Hoá đến năm 2020 và định hướng đến năm 2030. Trong đó, giai đoạn 2015 - 2020 đầu tư phát triển trang trại chăn nuôi lợn ngoại quy mô lớn, chăn ni khép kín tại các huyện miền núi và trung du với tổng quy mô 40.000 - 50.000 lợn ngoại, tăng tỷ lệ chăn nuôi theo hướng công nghiệp và giảm tỷ lệ chăn nuôi nhỏ lẻ.
4.1.2. Tình hình mắc PED trên đàn lợn tại 6 huyện của tỉnh Thanh Hoá
Để đánh giá tình hình mắc PED, đàn lợn được theo dõi theo các tiêu chí: vùng địa lý, độ tuổi, quy mô đàn và mùa vụ. Lợn ở các trại được theo dõi trực tiếp và điền thông tin vào phiếu theo dõi khi nghi mắc PED, tiến hành chọn mỗi đàn 1-2 lợn có biểu hiện lâm sàng điển hình (tiêu chảy phân vàng xám, gầy sút
53
nhanh, giảm ăn (bú), nằm dồn đống hoặc nằm trên bụng mẹ), sau đó tiến hành chẩn đoán nhanh bằng Test kit PED Ag và RT-PCR để xác định chính xác bệnh. Những lợn cịn lại ở trong đàn nếu có những biểu hiện tương tự lợn có kết quả Test kit PED Ag và RT-PCR dương tính cũng được xác định là mắc PED.