Máu là một chất dịch lỏng lưu thông trong tim và hệ thống mạch quản, là nguồn gốc của hầu hết các dịch thể trong cơ thể. Khi máu ngấm vào tế bào tổ
34
chức tạo thành dịch nội bào, máu ngấm vào khe hở giữa các tế bào thành dịch gian bào, máu đi vào ống lâm ba tạo nên dịch bạch huyết, máu vào não tuỷ tạo nên dịch não tuỷ. Các đặc tính của máu, thành phần của máu phản ánh tình trạng dinh dưỡng và sức khoẻ của cơ thể, vì vậy những xét nghiệm về máu là những xét nghiệm cơ bản được dùng để đánh giá tình trạng sức khoẻ cũng như giúp cho việc chẩn đoán bệnh (Everds, 2006; Forbes & cs., 2009).
Trong chăn nuôi, các chỉ số về huyết học đóng vai trò rất quan trọng và được xem như là các chỉ thị về trạng thái sinh lý của cơ thể, là vật liệu ban đầu để đánh giá phẩm chất của giống và phục vụ công tác lai tạo giống. Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hemoglobin, protein và các tiểu phần protein huyết thanh) có liên quan đến đặc tính di truyền, quá trình sinh trưởng và phát triển, khả năng sinh sản và khả năng thích nghi của động vật với các môi trường sống khác nhau (Mesa & cs., 2012; Schäfers, 2013).
Máu gồm hai thành phần: thể hữu hình (huyết cầu) và huyết tương. Các thể hữu hình của máu là hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, chiếm 43 - 45% tổng số máu, chỉ số này được gọi là hematocrit. Hồng cầu là thành phần chiếm chủ yếu trong thể hữu hình. Huyết tương chiếm 55 - 57% tổng số máu (Lê Văn Thọ & Đàm Văn Tiện, 1992).
2.6.1. Huyết tƣơng
Huyết tương chứa nước, protein, các chất điện giải, các hợp chất hữu cơ và vô cơ, các hocmon, các vitamin, các chất trung gian hoá học, các sản phẩm chuyển hoá... Huyết tương chứa toàn bộ các chất cần thiết cho cơ thể và toàn bộ các chất cần được thải ra ngoài. Huyết tương bị lấy mất fibrinogen thì được gọi là huyết thanh. Huyết tương là dung dịch chứa đến 96% nước, 4% là các protein huyết tương và rất nhiều chất khác với một lượng nhỏ, đôi khi chỉ ở dạng vết. Các thành phần chính của huyết tương gồm: Albumin; Các globulin miễn dịch hay kháng thể; Các chất điện giải; Các yếu tố đông máu; Các hormone và các chất thải khác của cơ thể (Lê Văn Thọ & Đàm Văn Tiện, 1992).
2.6.2. Thành phần có hình trong máu
2.6.2.1. Hồng cầu
Hồng cầu hay hồng huyết cầu (có nghĩa là tế bào máu đỏ), là loại tế bào máu có chức năng chính là hô hấp, chuyên chở hemoglobin, qua đó đưa O2 từ phổi đến các mô. Enzyme carbonic anhydrase trong hồng cầu làm tăng hàng nghìn lần vận tốc của phản ứng giữa CO2 và H2O tạo ra H2CO3. Nhờ đó, nước trong huyết tương vận chuyển CO2 dưới dạng ion bicarbonat (HCO3—) từ các mô
35
trở lại phổi để CO2 được tái tạo và thải ra dưới thể khí. Hồng cầu được tạo ra từ các tế bào máu gốc trong tủy xương, đa số hồng cầu bị hủy ở lách. Số lượng hồng cầu thay đổi phụ thuộc vào giống, tuổi, giới tính, chế độ dinh dưỡng, trạng thái cơ thể khoẻ mạnh hay bệnh tật, môi trường khí hậu, tốc độ sinh trưởng. Tuy nhiên, số lượng hồng cầu cần phải đủ để đảm bảo vận chuyển oxy cho mô bào, bất kỳ lí do gì làm giảm lượng oxy cung cấp cho tế bào đều làm tăng quá trình sản sinh hồng cầu (Lê Văn Thọ & Đàm Văn Tiện, 1992).
Thành phần chủ yếu của hồng cầu là huyết sắc tố hemoglobin (Hb) chiếm 90% vật chất khô của hồng cầu và đảm nhiệm các chức năng của hồng cầu. Hemoglobin là một hợp chất protein phức tạp dễ tan trong nước, trong thành phần cấu tạo có một phân tử globin (chiếm 96%) kết hợp với 4 phân tử hem (chiếm 4%). Globin có tính đặc trưng cho từng loài, vì vậy kiểu Hb mang đặc trưng di truyền của phẩm giống, do đó trong chăn nuôi có thể xác định các giống khác nhau qua kiểu Hb của từng cá thể. Theo Nguyễn Thị Tường Vy & Nguyễn Đức Hưng (2011), lợn Cỏ ở Thừa Thiên Huế có hàm lượng hemoglobin, lúc sơ sinh, 4, 8 tháng tuổi lần lượt là: 10,00g%; 12,74g%; 10,6g% ở lợn đực và 8,46g%; 10,7g%; 10,00g% ở lợn cái. Hàm lượng Hb của lợn sơ sinh trong tổ hợp lai (Lx MC) x D ở con đực 9,18 (g%) và con cái là 9,02 (g%); ở tổ hợp lai (L x MC) x (Pi – Du) ở con đực là 9,50 (g%) và ở con cái là 8,95 (g%). Ở giai đoạn 4 tháng tuổi, hàm lượng Hb của con lai trong tổ hợp lai (Lx MC) x D ở con đực là 13,27 (g%) và ở con cái là 12,37 (g%). Số lượng hồng cầu ở tổ hợp lai (Lx MC) x D và tổ hợp lai (L x MC) x (Pi – Du): Ở con đực lần lượt là 4,47; 4,85 (triệu/mm3) và ở con cái lần lượt là 4,29; 4,40 (triệu/mm3). Số lượng hồng cầu ở giai đoạn 4 tháng tuổi ở tổ hợp lai (L x MC) x D và tổ hợp lai (L x MC) x (Pi – Du), con đực lần lượt là 7,50; 7,62 (triệu/mm3) ở con cái là 7,12 và 7,02 (triệu/mm3) (Nguyễn Thị Tường Vy & Đinh Văn Dũng, 2016).
2.6.2.2. Bạch cầu
Bạch cầu, hay bạch huyết cầu là một thành phần của máu. Chúng giúp cho cơ thể chống lại các bệnh truyền nhiễm và các vật thể lạ trong máu.
Theo Lê Văn Thọ & Đàm Văn Tiện (1992), có 5 loại tế bào bạch cầu: Bạch cầu ưa kiềm, bạch cầu ưa axit, bạch cầu trung tính, bạch cầu mônô và bạch cầu lympho. Tuy nhiên bạch cầu được phân thành ba loại chính:
36
- Bạch cầu hạt (granulocyte) được đặc trưng bởi các hạt nhuộm màu khác nhau trong tế bào chất dưới kính hiển vi quang học. Có ba loại bạch cầu hạt: bạch cầu trung tính (neutrophil), bạch cầu ái kiềm (basophil) và bạch cầu ái toan (eosinophil) (được đặt tên theo các thuộc tính nhuộm màu của chúng). Trước đây, bạch cầu hạt còn được gọi (không chính xác) là "bạch cầu đa nhân" do đặc điểm phân thùy (múi) của nhân tế bào. Ngoài ra cũng có thể gọi những bạch cầu có hạt là bạch cầu có nhân đa hình (vì nhân của nó thường được phân thành nhiều múi khác nhau và thường có từ 1 - 5 múi). Người ta sử dụng yếu tố phân múi này để định công thức bạch cầu Arneth.
- Tế bào lympho: Là các tế bào chuyên biệt của hệ miễn dịch, các tế bào lympho (lymphocyte) rất phổ biến trong hệ bạch huyết. Trong máu có ba loại lymphocyte: tế bào B, tế bào T và các tế bào NK. Các tế bào B sản xuất ra kháng thể liên kết với tác nhân gây bệnh nhằm tạo điều kiện để có thể phá hủy chúng. Các tế bào T CD4+ (T bổ trợ) phối hợp các phản ứng của hệ miễn dịch (loại tế bào này bị suy giảm khi cơ thể bị nhiễm virus HIV). Các tế bào T CD8+ (T gây độc) và tế bào giết tự nhiên có khả năng giết các tế bào của cơ thể bị nhiễm các tác nhân gây bệnh nội bào.
- Bạch cầu đơn nhân (monocyte) chia sẻ chức năng ―dọn dẹp chân không‖ của bạch cầu trung tính, nhưng chúng có đời sống dài hơn bởi chúng còn có vai trò bổ sung khác. Bạch cầu đơn nhân trong máu cũng như các bản sao của chúng ở các mô - thực bào rồi đưa các kháng nguyên của tác nhân gây bệnh tới trình diện cho tế bào T. Bạch cầu đơn nhân trưởng thành có thể biệt hóa thành đại thực bào tại các mô khác nhau của cơ thể.
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Tường Vy & Nguyễn Đức Hưng (2011); Nguyễn Thị Tường Vy & Đinh Văn Dũng (2016): Số lượng bạch cầu (nghìn/mm3) lúc sơ sinh của lợn đực là 13,11; lúc 12 tháng tuổi là 22,57; ở lợn cái, tương ứng là 14,04 và 18,43. Công thức bạch cầu thay đổi theo tuổi: bạch cầu lâm ba có tỷ lệ cao nhất và giảm dần từ sinh đến 12 tháng tuổi, ở lợn đực tương ứng là 51,20% và 42,20%, còn ở lợn cái là 56,13% và 41,66%; bạch cầu trung tính tăng dần qua các tháng tuổi và không có sự sai khác giữa lợn đực và lợn cái; bạch cầu ái toan tăng nhẹ từ lúc sơ sinh đến 12 tháng tuổi.
37
PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu của luận án là bệnh PED trên đàn lợn lai ba máu nuôi tại các trang trại và gia trại thuộc tỉnh Thanh Hoá.
3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Địa điểm theo dõi và lấy mẫu tại các trang trại và gia trại nuôi lợn tại 6 huyện bao gồm: Hoằng Hoá, Nông Cống, Như Thanh, Tĩnh Gia, Thạch Thành và Yên Định của tỉnh Thanh Hoá.
Mẫu được xử lý và phân tích tại phòng thí nghiệm Bộ môn Nội - Chẩn – Dược – Độc chất, khoa Thú y. Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam. Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ vắc-xin, Công ty RTD. Phòng thí nghiệm Chăn nuôi thú y, Trường Đại học Hồng Đức.
3.3. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2014 đến tháng 01/2020.
3.4. TRANG THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.4.1. Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 3.4.1. Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
- Các loại máy móc, thiết bị: Máy phân tích huyết học Abbott Cell-Dyn 3700; máy quang phổ hấp phụ; máy xét nghiệm ELISA, máy RT-PCR; khúc xạ kế Zena; glucometer; máy cắt mảnh Microtom, kính hiển vi quang học, máy li tâm, máy điện di.
- Dụng cụ: Tủ âm, khuôn đúc, trang thiết bị phòng thí nghiệm (dao, kéo, panh...).
3.4.2. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm (phân, ruột): Lấy khoảng 5g từ những lợn có triệu chứng của PED và dương tính với Test kit PED Ag, cho vào trong túi nylon vô trùng, bảo quản (40C) và vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ để sử dụng phương pháp RT-PCR chẩn đoán xác định lợn mắc bệnh.
- Lợn khoẻ mạnh và lợn mắc PED là lợn lai 3 máu ở tuần tuổi thứ 2 (là con của các lợn nái đã được tiêm phòng các loại vacxin phòng bệnh như Dịch tả
38
lợn cổ điển, PRRS, PCV2, Tụ - Dấu, Phó thương hàn. Có kết quả RT-PCR âm tính với Dịch tả lợn cổ điển, PRRS và kết quả PCR âm tính với PCV2) để khám lâm sàng, xác định các chỉ tiêu lâm sàng và lấy mẫu máu để xác định các chỉ tiêu huyết học và điều trị thử nghiệm.
- Xác chết của lợn mắc PED ở tuần tuổi thứ 2 (dương tính với virus PED bằng phương pháp Test kit PED Ag và RT-PCR) để mổ khám bệnh tích đại thể và làm tiêu bản bệnh tích vi thể.
- Ruột lợn dưới 1 tuần tuổi mắc PED để làm chế phẩm ―Gut feedback‖ trong phòng bệnh.
- Lợn nái khoẻ mạnh mang thai tuần thứ 13 để thử nghiệm phương pháp phòng bệnh ―Gut feedback‖.
- Máu của lợn nái sau khi dùng thử nghiệm phương pháp phòng bệnh ―Gut feedback‖ có biểu hiện tiêu chảy ngày thứ 14 và 21 để xác định kháng thể trong huyết thanh.
- Bộ Test kit PED Ag (Công ty Zoetis) phát hiện được sự hiện diện của virus PED có trong phân lợn (Hình 3.1).
Hình 3.1. Test kit PED Ag
3.4.3. Hóa chất
- Kit tách chiết QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen), Primers; - Hóa chất: Formol 10%, cồn ở các nồng độ, xylen, paraffin...
3.5. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.5.1. Tình hình dịch tiêu chảy cấp ở lợn (PED) tại Thanh Hoá
- Tình hình chăn nuôi lợn tại Thanh Hoá giai đoạn từ năm 2016 đến 2019; - Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo vị trí địa lý: Đồng bằng (huyện Yên Định và Nông Cống), ven biển (huyện Hoằng Hoá và Tĩnh Gia) và trung du miền núi (huyện Như Thanh và Thạch Thành);
39
- Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo đối tượng lợn: lợn con theo mẹ, lợn cai sữa, lợn thịt, lợn nái và lợn đực giống;
- Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo mùa: Xuân – Hạ - Thu – Đông;
- Xác định tỷ lệ mắc bệnh, tỷ lệ chết và tỷ lệ tử vong theo quy mô đàn:Gia trại: Dưới 20 lợn nái hoặc dưới 100 lợn thịt; Trại nhỏ: từ 20-50 lợn nái hoặc từ 100-250 lợn thịt; Trại lớn: trên 50 lợn nái hoặc trên 250 lợn thịt (Thông tư số 69/2000/TTLB-BNN-TCTK).
3.5.2. Một số đặc điểm bệnh lý ở lợn mắc dịch tiêu chảy cấp tại Thanh Hoá
- Xác định triệu chứng lâm sàng ở lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED); - Xác định chỉ tiêu lâm sàng ở lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED): Thân nhiệt, tần số hô hấp, tần số tim;
- Xác định bệnh tích đại thể của lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED);
- Xác định biến đổi bệnh lý vi thể ở tá tràng, không tràng, hồi tràng và kết tràng của lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED);
- Xác định một số chỉ tiêu huyết học của lợn mắc PED: các chỉ số hồng cầu; các chỉ số bạch cầu và các chỉ số sinh hóa máu.
3.5.3. Thử nghiệm biện pháp phòngtrị dịch tiêu chảy cấp ở lợn(PED)
- Phòng dịch tiêu chảy cấp ở lợn (PED) bằng phương pháp ―Gut feedback‖của Thai Swine Veternary Association (2015) để phòng bệnh.
- Điều trị thử nghiệm lợn mắc dịch tiêu chảy cấp (PED).
3.6. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.6.1. Phƣơng pháp xác định tình hình dịch tiêu chảy cấp ở lợn (PED)
3.6.1.1. Phương pháp điều tra dịch tễ học
- Áp dụng các phương pháp điều tra dịch tễ học thường quy: Lợn ở các trại được theo dõi trực tiếp và điền thông tin vào phiếu theo dõi (có mẫu phiếu kèm theo).
- Sau khi điều tra xác định đàn lợn nghi mắc PED, tiến hành chọn mỗi đàn 1-2 lợn có biểu hiện lâm sàng điển hình (tiêu chảy phân vàng xám, gầy sút nhanh, giảm ăn (bú), nằm dồn đống hoặc nằm trên bụng mẹ), sau đó tiến hành lấy mẫu phân chẩn đoán nhanh bằng Test kit PED Ag và RT-PCR để xác định
40
chính xác bệnh. Những lợn còn lại ở trong đàn nếu có những biểu hiện tương tự lợn có kết quả Test kit PED Ag và RT-PCR dương tính cũng được xác định là mắc PED.
- Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc hội chứng tiêu chảy được xác định bằng phương pháp khám lâm sàng thường quy, quan sát, ghi chép các tiêu chí như trạng thái phân, thể trạng của lợn.
- Xác định tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết (MR) và tỷ lệ tử vong (CFR) của lợn theo công thức tiêu chuẩn của Nguyễn Như Thanh & cs. (2011).
Tỷ lệ mắc bệnh (%) = Số con mắc bệnh 100 Tổng số con theo dõi
Tỷ lệ chết (%) =
Số con chết
100 Tổng số con theo dõi
Tỷ lệ tử vong (%) = Số con chết 100 Tổng số con mắc bệnh
Tiến hành quan sát, thu thập, ghi chép, các biểu hiện của lợn trước khi mổ khám; các bệnh tích đại thể. Sau khi thu thập đầy đủ thông tin, tiến hành thống kê lại các chỉ tiêu theo dõi và phân tích, hồi cứu để đưa ra những kết quả chính xác.
3.6.1.2. Phương pháp chẩn đoán bệnh bằng Test kit PED Ag
a. Nguyên lý
Test kit PED Ag dựa trên nguyên lý kỹ thuật sắc ký miễn dịch sử dụng phương pháp Direct Sandwich. Hai kháng thể đơn dòng trong thiết bị kết hợp đặc thù với các vùng quyết định kháng nguyên khác nhau của kháng nguyên cần chẩn đoán. Sau khi cho bệnh phẩm thấm vào vị trí đệm cellulose của thiết bị, các kháng nguyên của virus PED sẽ di chuyển và kết hợp với hợp chất thể keo màu vàng chứa kháng thể đơn dòng kháng virus PED, để tạo thành phức hợp ―Kháng nguyên – Kháng thể‖. Sau đó, phức hợp này kết hợp với kháng thể đơn dòng kháng virus PED khác trong màng Nitơ-cellulose của thiết bị, để tạo thành phức chất kẹp hoàn chỉnh ―Kháng thể - Kháng nguyên – Kháng thể‖.
41
b. Phương pháp thực hiện
- Tất cả các thành phần có trong test bao gồm: Dung dịch pha loãng; tăm bông; dụng cụ thử cho kết quả được lấy ra và để ở nơi bằng phẳng, sạch sẽ, thoáng mát.
- Lấy mẫu phân (để thăm dò sự hiện diện của virus PED) được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất của bộ kit PED-Ag test kit (Hình 3.2).
Hình 3.2. Các bước tiến hành kiểm tra mẫu bệnh bằng Test kit PED Ag
c. Đọc kết quả
- Phản ứng xảy ra khi có đường màu tím chạy dọc trên bảng kết quả (nằm ở giữa dụng cụ xét nghiệm) ngay cạnh lỗ tròn chứa dung dịch bệnh phẩm. Sau 1 phút nếu không thấy có sự di chuyển của màu tím, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch bệnh phẩm.Đọc kết quả 5-10 phút.