Dự án khoa học & công nghệ (KHCN) bắt đầu thực hiện từ năm 2013 về danh mục các nhiệm vụ của sản phẩm quốc gia “Sản xuất vắc xin phòng bệnh cho vật nuôi của Việt Nam”; trong đó có nội dung giao cho Công ty RTD tổ chức thực hiện dự án “Công nghệ sản xuất vắc xin phòng bệnh lở mồm long móng cho gia súc” trong giai đoạn 2014 – 2018. Trong giai đoạn này, công ty đã có kết quả bước đầu trong công tác chọn giống phân lập từ các địa phương và hoàn thành hồ sơ giống các týp O, A và Asia1 để sử dụng sản xuất vắc xin. Bước sang giai đoạn 2018-2020, với mục tiêu sản xuất vắc xin đơn giá và đa giá týp O, A từ các chủng đã phân lập, đạt các chỉ tiêu vô trùng, an toàn và hiệu lực, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tính sinh miễn dịch của chủng vi rút O/FMD/Avac3 (sau đây gọi là chủng O3) với các chất bổ trợ khác nhau và tính tương đồng kháng nguyên với các chủng thực địa khác.
4.1. ĐẶC TÍNH DI TRUYỀN CỦA CHỦNG GIỐNG
Kết quả phân tích - so sánh trình tự gen mã hóa protein VP1 của chủng vi rút O3 với 20 chủng vi rút týp O phát hiện được ở Việt Nam từ 2006- 2019 được trình bày ở hình 4.1.
So với các chủng vi rút cùng týp huyết thanh, chủng vi rút O3 khác biệt về khoảng cách di truyền tương đối rộng (0,036 đến 0,179). Kết quả đó là do có sự hiện diện nhiều topotype vi rút LMLM týp O ở Việt Nam, trình bày ở hình 4.2.
Hình 4.2. Mối liên hệ di truyền dựa vào gen VP1 của vi rút LMLM týp O
Dựa vào trình tự gen công bố ở GenBank, đến năm 2019 ở Việt Nam có ít nhất 3 topotype vi rút LMLM týp O là Cathay, SEA và ME-SA. Trong đó chủng vi rút O3 thuộc topotype ME-SA. Các chủng vi rút LMLM thuộc topotype ME-
SA vẫn hiện diện ở Việt Nam cho tới những năm gần đây. Như vậy, chủng vi rút dùng nghiên cứu sản xuất vắc xin LMLM là một trong những đại diện của 3 topotype vi rút lưu hành ở Việt Nam. Các phần dưới đây trình bày kết quả xác định chỉ tiêu về đáp ứng miễn dịch của vắc xin chế tạo từ chủng O3.
4.2. KHẢ NĂNG SẢN SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH 4.2.1. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm một mũi vắc xin
Theo khuyến cáo của OIE, lượng vi rút LMLM đưa vào sản xuất vắc xin cần thiết là ≥ 6,5 log10 TCID50/ml. Trong nghiên cứu khả năng kích thích sản sinh đáp ứng miễn dịch, chúng tôi đưa ra các khung nồng độ vi rút trước vô hoạt là: 6 log10, 7 log10, 7,5 log10 TCID50/ml. Đáp ứng miễn dịch của lợn được đánh giá bằng phương pháp trung hòa, với kết quả minh họa ở hình 4.3.
Ghi chú: giá trị 1/x là độ pha loãng huyết thanh xét nghiệm. Đóng khung màu xanh/ màu đỏ tương ứng là độ pha loãng tại đó trung hòa hoàn toàn/ không trung hòa vi rút
Kết quả trên cho biết ở nhóm đối chứng có sự khác biệt rõ giữa đối chứng
virút (phá hủy hoàn toàn thảm tế bào) và đối chứng âm không có vi rút (thảm tế bào còn nguyên vẹn). Ở nhóm xét nghiệm, theo độ pha loãng tăng dần (hàm lượng kháng thể trung hòa vi rút LMLM giảm dần), thảm tế bào bị phá hủy càng rõ. Trong hình 4.3, ngưỡng mà tại đó trung hòa hoàn toàn vi rút được xác định là 1/32. Biến động hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút LMLM ở nhóm lợn sau tiêm một mũi vắc xin được tổng hợp ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi tiêm 1 mũi vắc xin
Lượng vi rút/ liều vắc xin 6 log10 (N1) 7 log10 (N3) 7,5 log10 (N5) Đối chứng (N7)
Lợn thuộc nhóm đối chứng tại tất cả các thời điểm lấy mẫu đều không chuyển dương tính với kháng thể kháng vi rút LMLM (hàng thứ 6, bảng 4.1). Ở nhóm gây miễn dịch quan sát được hiện tượng chuyển dương tính tại các thời điểm sau tiêm. Cụ thể như sau:
Nhóm N1 (liều gây miễn dịch 6 log10 TCID50/ml), hiệu giá kháng thể của lợn có chiều hướng tăng sau tiêm cho đến thời điểm D35. Cụ thể hiệu giá kháng thể tăng từ 0,9 log10 đến cao nhất là 1,29 log10 (tại thời điểm 35 ngày sau tiêm). Tuy nhiên, sau đó đáp ứng miễn dịch của lợn giảm dần tại các thời điểm lấy máu: D42 đến D56. Đến thời điểm 56 ngày, xác định hiệu giá kháng thể của lợn chỉ đạt 0,96 log10.
Ở nhóm N3 (liều gây miễn dịch 7 log10 TCID50/ml), kháng thể tăng từ ngày thứ 21 sau tiêm và đạt cao nhất tại thời điểm 28 ngày sau tiêm là 1,35 log10. Các thời điểm 35, 42, 49 và 56 ngày hiệu giá giảm dần và kết quả tại 56 ngày. Kết quả cho thấy, mặc dù lượng vi rút gây miễn dịch tăng gấp 10 lần so với nhóm N1, nhưng đáp ứng miễn dịch không được tăng cường một cách tuyến tính.
Tương tự với nhóm thí nghiệm N5 (liều gây miễn dịch 7,5 log10 TCID50/ml), nồng độ vi rút tiếp tục tăng nhưng kháng thể đạt từ 0,9 log10 đến thời điểm đạt cao nhất là 1,2 log10 ở 35 ngày sau tiêm, kháng thể của lợn tiếp tục giảm dần sau 56 ngày theo dõi. Như vây cả 3 nhóm lợn khi được tiêm 1 mũi vắc xin (N1, N3 và N5) tại các nồng độ vi rút khác nhau đều cho đáp ứng miễn dịch. Để làm rõ sự khác biệt về mức độ, biến động hiệu giá kháng thể và tương quan với các tiêu chuẩn về ngưỡng bảo hộ, kết quả trình bày ở bảng 4.1 được biểu diễn
ở hình 4.4.
Hình 4.4. Biến động hiệu giá kháng thể ở lợn sau khi tiêm 1 mũi vắc xin
Kết quả cho thấy rõ hiện tượng chuyển dương tính huyết thanh học ở nhóm lợn được gây miễn dịch. Thời điểm bắt đầu chuyển âm tính - dương tính là ngày 21 sau tiêm. Thời điểm chuyển dương tính - âm tính xảy ra tại thời điểm 49 ngày sau tiêm. Sự sai khác về mức độ đáp ứng miễn dịch, xu hướng biến động hiệu giá kháng thể không khác biệt rõ giữa các liều gây miễn dịch. Mặc dù lợn có đáp ứng miễn dịch, nhưng đối chiếu với ngưỡng dương tính (theo OIE) và ngưỡng bảo hộ (theo TCVN) đáp ứng miễn dịch được kích thích sinh sau khi tiêm 1 mũi vắc xin chưa đạt.
Vắc xin LMLM được tiêm cho các nhóm lợn là vắc xin vô hoạt nhũ dầu. Theo các nghiên cứu trước đây, vắc xin vô hoạt sẽ kích thích cơ thể gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể (kháng thể trung hoà). Hơn nữa, kháng thể trung hoà
đóng vai trò quan trọng giúp cơ thể chống lại vi rút LMLM và có mối tương quan chặt chẽ đến khả năng bảo hộ của cơ thể. Vì vậy, nghiên cứu đã sử dụng phương pháp trung hoà trên tế bào để đánh giá đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi tiêm 1 mũi vắc xin LMLM vô hoạt.
Biến động hiệu giá kháng thể trung hòa của cả 3 nhóm lợn tăng theo quy luật hình thành kháng thể đặc hiệu. Kháng thể không sinh ra ngay sau khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, mà chỉ xuất hiện sau 6-7 ngày, hơn nữa, vắc xin sử dụng là vắc xin vô hoạt nên kháng thể hình thành chậm hơn, đến ngày thứ 21 sau tiêm, kháng thể mới bắt đầu xuất hiện, và đạt mức tối đa sau 2 tuần (35 ngày sau tiêm) sau đó hàm lượng kháng thể từ từ giảm dần và biến mất.
Ở nội dung nghiên cứu này, mặc dù động vật được sử dụng đạt yêu cầu thí nghiệm, âm tính vi rút và không có kháng thể kháng vi rút LMLM, nhưng hiệu giá kháng thể cũng chỉ được ở mức nghi ngờ tại thời điểm kháng thể cực đại (> 1,21 log10, theo OIE). Vì vậy, đối với vắc xin thử nghiệm từ giống O3 chỉ tiêm một mũi cho lợn là không đủ. Mặc dù trên thế giới, cũng đã có nghiên cứu về vắc xin LMLM tiêm một mũi cho lợn và cũng đã có thành công bước đầu như vắc xin vector vi rút (hAd5 –FMD) cho kết quả tương tự vắc xin vô hoạt, có khả năng bảo hộ gia súc và lợn với chỉ một liều và có khả năng bảo hộ sớm (sau 7 ngày tiêm vắc xin) (Grubman & cs., 2010) nhưng việc sản xuất đòi hỏi công nghệ và kĩ thuật cao, đây là cơ sở mở ra một con đường phát triển vắc xin
LMLM trong tương lai. Một vài công bố trên thế giới cho biết có thể dùng vắc xin LMLM vô hoạt với 1 liều tiêm duy nhất cũng đủ tạo đáp ứng miễn dịch bảo hộ cho lợn (Liao & cs., 2003). Tuy nhiên, cần lưu ý rằng các nghiên cứu kể trên đều dùng liều kháng nguyên gây miễn dịch rất cao (tối thiếu là 6 PD50/ liều) (Liao & cs., 2003; Nagendrakumar & cs., 2015).
4.2.2. Đáp ứng miễn dịch của lợn sau tiêm hai mũi vắc xin
Hiệu giá kháng thể trung hoà của lợn ở nhóm tiêm 2 mũi vắc xin được thể hiện trong bảng 4.2 và hình 4.5.
Bảng 4.2. Đáp ứng miễn dịch của lợn sau tiêm 2 mũi vắc xinLượng vi Lượng vi rút/ liều vắc xin 6 log10 (N2) 7 log10 (N4) 7,5 log10 (N6) Đối chứng (N9)
Có thể thấy nhóm lợn đối chứng không chuyển dương tính huyết thanh học trong suốt thời gian thí nghiệm. Ở lô thí nghiệm này, cũng quan sát được sự tăng hiệu giá kháng thể trung hòa ở cả 3 nhóm (liều gây miễn dịch 6 - 7 - 7,5 log10 TCID50/ml) ở thời điểm 21 ngày sau vắc xin mũi 1 (0,9 log10 tăng lên 0,96 - 0,99 log10). Đáng chú ý, hiệu giá kháng thể trung hòa sau tiêm mũi 2 tiếp tục tăng cho đến ngày D56 (thời điểm kết thúc theo dõi). Tại thời điểm 56 ngày, kháng thể trung hoà được xác định của 3 nhóm N2 (liều gây miễn dịch 6 log10 TCID50/ml), N4 (liều gây miễn dịch 7 log10 TCID50/ml) và N6 (liều gây miễn dịch 7,5 log10 TCID50/ml) lần lượt là 2,02 log10; 2,49 log10 và 2,26 log10.
Biến động hiệu giá kháng thể và tương quan với các tiêu chuẩn về ngưỡng bảo hộ sau tiêm 2 mũi được trình bày ở hình 4.5.
Chuyển dương tính huyết thanh học ở nhóm lợn gây miễn dịch bắt đầu xuất hiện ở ngày 21 sau tiêm mũi 1. Sau thời điểm tiêm nhắc lại (D28 sau tiêm mũi 1), kháng thể trung hòa tiếp tục tăng và vượt ngưỡng dương tính (theo tiêu chí OIE) tại thời điểm D42. Tại thời điểm D56, hiệu giá kháng thể trung hòa ở cả 3 nhóm gây miễn dịch (với liều 6 - 7 - 7,5 log10 TCID50/ml) đã đạt ngưỡng bảo hộ theo TCVN (hiệu giá trung hòa ≥ 2 log10). Trong lô thí nghiệm này, hiệu giá trung hòa trên ngưỡng bảo hộ tiếp tục được duy trì cho đến thời điểm dừng theo dõi.
Các kết quả trình bày ở bảng 4.1- 4.2 và hình 4.4- 4.5 cho thấy đáp ứng miễn dịch kích thích sản sinh bởi vắc xin LMLM sản xuất từ chủng vi rút O3 phụ thuộc chủ yếu vào quy trình gây miễn dịch, trong đó gây miễn dịch 1 lần không đủ tạo đáp ứng miễn dịch ở ngưỡng bảo hộ so với gây miễn dịch 2 lần. Hình 4.6 được tổng hợp để làm rõ khác biệt kể trên.
Hình 4.6. So sánh hiệu giá kháng thể ở lợn tại thời điểm D28 và D56
Tại thời điểm 28 ngày sau tiêm vắc xin, kết quả gây miễn dịch cho lợn bằng 1 mũi hoặc 2 mũi vắc xin đều không có khác biệt về hiệu giá kháng thể trung hòa tại (p > 0,05). Tuy nhiên, tại thời điểm D56 sau tiêm vắc xin mũi 1, lợn ở nhóm được tiêm 2 mũi vắc xin có hiệu giá kháng thể sai khác rõ ràng so với lợn ở nhóm được tiêm 1 mũi vắc xin (p < 0,05). Hiệu giá kháng thể của các nhóm lợn tiêm 2 mũi vắc xin cao hơn hẳn so với các nhóm lợn được tiêm 1 mũi vắc xin cùng nồng độ.
Hàm lượng kháng thể trung hòa tăng cao rõ rệt sau mũi tiêm nhắc lại phù hợp với quy luật hình thành kháng thể đặc hiệu, đưa kháng nguyên vào đúng liều lượng và được tiêm nhắc lại, kháng thể xuất hiện sẽ nhanh và cao hơn do được tiếp xúc với các tế bào “nhớ”. Đáp ứng miễn dịch khi gia súc tiêm phòng lần đầu có thể chỉ sau 6 tuần khả năng bảo hộ không còn đảm bảo, vì vậy để duy trì đáp ứng miễn dịch và nâng cao khả năng miễn dịch của động vật cứ sau một khoảng thời gian nhất định cần tiêm nhắc lại. Có tác giả còn khuyến cáo, để đạt được hiệu quả tốt khi tiêm phòng vắc xin LMLM cho lợn, việc tiêm phòng lần đầu nên được thực hiện khi lợn từ 10- 12 tuần tuổi, tiêm nhắc lại sau 4 tuần (Chung & cs., 2002).
Trong nghiên cứu sản xuất vắc xin, một trong các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của cơ thể là liều lượng vi rút kháng nguyên trong một liều vắc xin. Theo một số kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng kháng thể đạt được sẽ tỷ lệ thuận với liều lượng kháng nguyên đưa vào ở một phạm vi nhất định. Nếu liều lượng kháng nguyên quá thấp sẽ không đủ kích thích cơ thể gây đáp ứng miễn dịch. Nếu liều lượng kháng nguyên quá cao sẽ dẫn đến gây độc cho cơ thể, hoặc tê liệt miễn dịch, có thể dung nạp đặc hiệu với lần gây miễn dịch tiếp theo, cuối cùng là ức chế khả năng sản sinh ra kháng thể. Ngày nay trên thế giới có nhiều phương pháp để xác định liều của vắc xin LMLM như: xác định hàm lượng 146S hoặc phương pháp lý tưởng là đánh giá đáp ứng miễn dịch của động vật (tính liều PD50) bằng cách công cường độc (Oie, 2018). Tuy nhiên phương pháp xác định hàm lượng 146S yêu cầu thiết bị đắt tiền. Hạn chế của phương pháp xác định PD50 là đòi hỏi phải có phòng an toàn sinh học cấp 3 cho cả phòng thí nghiệm và khu nuôi động vật thí nghiệm. Vì vậy, trong điều kiện cơ sở vật chất hiện tại và khuôn khổ của đề tài, dựa trên hàm lượng vi rút LMLM chuẩn độ trước khi vô hoạt chúng tôi xác định liều gây miễn dịch cho bản động vật. Tham chiếu TCVN 8685-10:2014 và tiêu chuẩn của OIE, hiệu giá kháng thể của lợn sau khi tiêm 2 mũi vắc xin của cả 3 nhóm liều kháng nguyên (6 - 7 - 7,5 log10 TCID50/ml) đều đạt chỉ tiêu hiệu lực của vắc xin LMLM. Mặt khác, yếu tố hàm lượng vi rút trước khi vô hoạt còn là yếu tố quyết định trong quy trình sản xuất và giá thành sản phẩm. Vì vậy, từ các kết quả thu được nêu trên, nồng độ vi rút sản xuất vắc xin LMLM vô hoạt nhũ dầu kép được chọn là 7 log10 TCID50/ml.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra ưu điểm nổi trội của việc sử dụng liều cao kháng nguyên vi rút LMLM (≥ 6PD50) trong việc (i) tạo ra đáp ứng
miễn dịch sớm (sau khi sử dụng vắc xin vô hoạt 4- 7 ngày) (Salt & cs., 1998; Nagendrakumar & cs., 2015), (ii) mở rộng khả năng bảo hộ chéo chống lại công cường độc (Brehm & cs., 2008) và (iii) vẫn đạt hiệu giá bảo hộ chỉ với 1 lần tiêm (Liao & cs., 2003). Do vậy, song song với việc sản xuất vắc xin LMLM từ chủng O3, cần tiếp tục nghiên cứu để nâng cao chất lượng vắc xin LMLM týp O ở tiêu chí nâng cao liều kháng nguyên.
4.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT BỔ TRỢ TỚI ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
Chất bổ trợ là những hợp chất thêm vào trong vắc xin nhằm làm tăng khả năng kích thích miễn dịch và hiệu lực của vắc xin. Chất bổ trợ có thể quyết định mức độ và độ dài quá trình đáp ứng miễn dịch của vắc xin. Đặc biệt đối với vắc xin vô hoạt, chất bổ trợ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả của vắc xin. Sau khi đã xác định được nồng độ vi rút (7 log10 TCID50/ml) và số lần tiêm vắc xin cho lợn (tiêm 2 mũi vắc xin, mũi 2 cách mũi 1 là 28 ngày), chúng tôi tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của bổ trợ keo phèn đến tính sinh miễn dịch của vắc xin. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể của vắc xin bổ trợ keo phèn được trình bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn Nhóm Thí nghiệm (K1) Đối chứng (K2)
Kết quả hiệu giá kháng thể trung hoà của lợn trong bảng 4.3 cho thấy, lợn có đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn. Kháng thể bắt đầu tăng tại thời điểm 14 ngày sau tiêm, đến 28 ngày sau tiêm vắc xin hiệu giá là 1,28 log10. Sau khi tiêm mũi 2 tại 28 ngày, kháng thể bắt đầu tăng dần, hiệu giá