Vắc xin là chế phẩm sinh học chứa kháng nguyên có thể kích thích cơ thể tạo nên đáp ứng miễn dịch và được dùng với mục đích phòng bệnh hoặc với mục đích khác (Nguyễn Bá Hiên, 2010).
Nguyên lý của vắc xin: vắc xin khi đưa vào cơ thể sống sẽ kích thích cơ thể tạo ra một đáp ứng miễn dịch. Hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, sinh ra kháng thể dịch thể đặc hiệu chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố gây bệnh, cơ thể sử dụng vắc xin xuất hiện trạng thái miễn dịch thu được chủ động nhân tạo có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của yếu tố gây bệnh tương ứng.
2.4.2. Thành phần của vắc xin
Vắc xin thông thường bao gồm hai thành phần chính là kháng nguyên (nguyên dịch) và chất bổ trợ.
Kháng nguyên:
Trước đây kháng nguyên được coi là một chất lạ có bản chất là protein, khi đưa vào cơ thể, kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể đặc hiệu và kháng thể đặc hiệu sẽ trung hoà kháng nguyên đó. Ngày nay, khi nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cơ thể người ta thấy rằng khi cơ thể nhận được kháng nguyên không chỉ sản sinh kháng thể đặc hiệu (đáp ứng miễn dịch dịch thể) mà còn tạo ra một lớp tế bào mẫn cảm. Tế bào này cũng có khả năng tạo phản ứng với kháng nguyên (miễn dịch tế bào). Vì vậy, hiện nay kháng nguyên được hiểu là những chất khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể sản sinh ra kháng thể và tế bào mẫn cảm đặc hiệu chống lại sự xâm nhập và gây bệnh của mầm bệnh.
Chất bổ trợ:
Chất bổ trợ là những hợp chất hóa học được thêm vào trong vắc xin, các chất này được trộn với kháng nguyên, có tác dụng kích thích hoặc thay đổi một cách không đặc hiệu đáp ứng miễn dịch chống kháng nguyên đó để nâng cao hiệu quả và độ dài miễn dịch.
Tác dụng của chất bổ trợ:
- Hấp thu và lưu giữ kháng nguyên trong cơ thể lâu hơn, không bài thải nhanh kháng nguyên
- Tạo kích thích đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cơ thể.
- Giảm kích thích phản ứng của độc tố (nếu có) trong vắc xin đối với cơ thể.
Căn cứ vào bản chất, thành phần cấu tạo của chất bổ trợ, người ta chia chất bổ trợ đang được dùng trong chế tạo vắc xin hiện nay thành các nhóm chính: chất vô cơ, chất hữu cơ, vi sinh vật.
Chất bổ trợ vô cơ: là các hợp chất nhôm, bao gồm nhôm phốt phát AlPO4, nhôm hydroxit Al(OH)3 và vắc xin kết tủa phèn, trong lịch sử gọi là protein aluminate, hiện là những chất bổ trợ được sử dụng phổ biến nhất với vắc xin cho người và thú y. Các chất bổ trợ vô cơ thường hấp phụ kháng nguyên lên bề mặt để tăng cường đáp ứng miễn dịch của cơ thể, đồng thời giải phóng kháng nguyên từ từ vào hệ bạch huyết để kéo dài thời gian kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ
thể. Với mầm bệnh có sản sinh độc tố, sau khi đã được vô hoạt (giải độc tố) cũng được chất bổ trợ hấp thu và giải phóng từ từ để hạn chế tác động gây phản ứng cục bộ và toàn thân. Trong thú y người ta hay dùng KAl (SO4)2.12H2O (gọi là keo phèn) trong các vắc xin vi khuẩn vô hoạt.
Chất bổ trợ hữu cơ: bao gồm các loại dầu thực vật, dầu hướng dương, dầu lạc, dầu oliu, các loại mỡ động vật, các sản phẩm dầu khoáng hoặc montanide 50…Bằng chứng đầu tiên về việc sử dụng nhũ tương dầu làm tá dược trong các công thức vắc xin có từ năm 1916. Các chất bổ trợ hữu cơ khi hỗn hợp với kháng nguyên sẽ tạo thành dạng nhũ tương nước trong dầu. Ở dạng nhũ tương kháng nguyên sẽ nằm trong dung dịch dầu. Để khắc phục những nhược điểm của vắc xin nhũ nước trong dầu như dễ phân lớp, rít kim khi tiêm, về sau người ta đã nghiên cứu chế tạo ra loại vắc xin dạng nhũ tương kép: nước trong dầu trong nước.
Tác dụng của chất bổ trợ dầu trong vắc xin cũng tương tự như tác dụng của chất bổ trợ vô cơ. Nhờ các phức hợp nhũ kháng nguyên - dầu - nước mà kháng nguyên tự do được giải phóng từ từ vào cơ thể để kích thích sản sinh kháng thể và tế bào miễn dịch đặc hiệu kéo dài. Đồng thời các hạt nhũ cũng di chuyển từ chỗ tiêm vào các hạch lympho hoặc đến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch để kích thích miễn dịch không đặc hiệu. Kết quả là liều vắc xin giảm, hiệu lực miễn dịch tăng cao, thời gian miễn dịch kéo dài.
Chất bổ trợ là vi sinh vật: thường dùng là xác của một số loài vi khuẩn như Mycobacterium tuberculosis hay Salmonella typhimurium. Cũng có thể dùng nội độc tố của các vi khuẩn lipopolysaccarid.
2.4.3. Độ ổn định của kháng nguyên LMLM
Cấu tạo toàn bộ vi rút lở mồm long móng chứa bốn loại hạt: (i) hạt vi rút 146S, bao gồm một phân tử ARN sợi đơn và 60 bản sao của bốn loại polypeptide VP1, VP2, VP3 và VP4; (ii) các hạt rỗng 75S, không có RNA và bao gồm 60 bản sao của mỗi VP1, VP3 và VP0 (tiền thân của VP2 và VP4); (iii) tiểu đơn vị 12S bao gồm năm bản sao (pentamer) của VP1, VP2 và VP3 nhưng không có VP4; và (iv) liên quan đến kháng nguyên (VIA) với hệ số sa lắng trong sucrose gradient là 3.5S.
Cơ thể sản sinh ra kháng thể trung hòa chủ yếu liên quan đến các hạt 146S, hạt 12S được tạo ra khi hạt 146S bị phá vỡ bởi a xít yếu hoặc làm nóng ở 56°C.
Kháng nguyên 12S có thể được coi là kháng nguyên tiền điện tử, nên kháng thể trung hòa trong huyết thanh được tạo ra từ các hạt 12S là thấp và không có ý nghĩa. Còn các hạt vi rút 75S được chứng minh là ổn định khi bất hoạt bằng AEI.
Ở 40C, chúng ổn định ít nhất 2 năm. Đặc tính của các hạt 75S cũng tương tự hạt 146S, có khả năng tạo ra kháng thể trung hòa nhưng kháng thể tạo ra thấp hơn kháng thể tạo ra từ hạt 146S. Nồng độ của kháng nguyên (tính bằng µg/ml) là phương pháp gián tiếp để xác định thời gian miễn dịch và khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Các hạt 146S được coi là thành phần miễn dịch chính của vi rút LMLM và bất kỳ yếu tố nào ảnh hưởng đến các hạt 146S đều có thể làm giảm hiệu lực của vắc xin. Theo M.M. Harmsen và cộng sự năm 2015, sự ổn định của 146S được kéo dài trong vòng 3 tháng bằng cách bổ sung đường và BSA bảo quản dưới dạng vắc xin nhũ dầu (Harmsen & cs., 2015).
Để xác định hàm lượng 146S, người ta sử dụng nhiều phương pháp. Phương pháp sucrose gradient cho kết quả nhanh chóng, nhưng lại đòi hỏi phải có thiết bị đắt tiền và cũng không phân biệt được hạt 146S còn nguyên vẹn và hạt 146S đã bị cắt bởi trysin (Van Maanen & Terpstra, 1990). Năm 1984, Ouldridge cùng cộng sự đã giới thiệu một phương pháp xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme sandwich (ELISA) để định lượng cụ thể hàm lượng 146S trong thu hoạch vi rút vắc xin và chỉ định lượng 146S, mà không phát hiện ra kháng nguyên 12S. Tuy nhiên, có nghiên cứu lại cho kết quả trái ngược, phương pháp này định lượng 146S cũng giống như 12S, nên không phù hợp để xác định hàm lượng toàn bộ vi rút. Do đó, chỉ xác định hàm lượng 146S, đã có nghiên cứu thử nghiệm phương pháp ELISA có sử dụng kháng thể kép (DAS) và đã được mô tả mối tương quan với phương pháp sucrose gradient (Van Maanen & Terpstra, 1990).
2.4.4. Các phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của động vật khi tiêm vắc xin LMLM
Hiện nay, để đánh giá đáp ứng miễn dịch hay hiệu quả sử dụng vắc xin dùng cho động vật, người ta sử dụng rất nhiều các phương pháp đánh giá; đánh giá trực tiếp khả năng kháng vi rút của động vật (phương pháp công cường độc) hoặc gián tiếp đánh giá hiệu giá kháng thể của động vật sau khi tiêm chủng.
Liều PD50 (protective dose 50) là liều bảo hộ 50% động vật thí nghiệm được tiêm vắc xin với các liều khác nhau sau khi thử thách công cường độc. Hiệu
lực của vắc xin biểu diễn số lượng liều PD50 (Oie, 2018). Ngày nay, liều PD50 trên bê được ước tính bằng cách sử dụng động vật thí nghiệm là bê ít nhất 6 tháng tuổi chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM. Bê được tiêm các liều vắc xin khác nhau (1/4, 1/8, 1/10...) với mỗi nồng độ ít nhất 5 con. Sau 3 tuần tiêm vắc xin, nhóm động vật được tiêm và nhóm đối chứng (2 con) được thử thách bằng vi rút công cường độc. Theo dõi động vật trong vòng 8 ngày và quan sát triệu chứng, bệnh tích của các nhóm. Từ số lượng động vật được bảo vệ mà tính toán liều PD50 theo công thức Karber. Vắc xin dự phòng thông thường nên chứa ít nhất 3 PD50, một số trường hợp có thể sử dụng 6 PD50. Tương tự đối với lợn, liều PD50 cũng được tính toán theo phương pháp trên. Liều PD50 có mối quan hệ với hàm lượng 146S xác định trong một liều vắc xin. Hàm lượng 146S yêu cầu để đạt được 1 PD50 là 2,2 µg/serotype/liều, mặc dù có thể quan sát thấy khả năng bảo hộ ở nồng độ kháng nguyên thấp hơn (Daoud & cs., 2013).
Các xét nghiệm gián tiếp là đánh giá hiệu giá kháng thể của động vật sau tiêm bằng phương pháp phản ứng trung hòa vi rút trên môi trường tế bào (VNT) hoặc phương pháp ELISA phát hiện kháng thể, hoặc phương pháp LPB- ELISA định lượng kháng thể, hay liều bảo hộ của vắc xin trên chuột lang chưa cai sữa (Maradei & cs., 2008). Dựa trên kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh, sẽ xây dựng được mối tương quan với hiệu lực của vắc xin đánh giá trên gia súc.
Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của vắc xin LMLM chỉ dựa vào giá trị tương đồng kháng nguyên là chưa thật sự chính xác (Trần Xuân Hạnh, 2020). Có nhiều thí nghiệm chứng minh giá trị r1 thấp không phải lúc nào cũng tương ứng với khả năng bảo hộ của vắc xin thấp. Ví dụ: vắc xin LMLM với hiệu lực > 6PD50 có thể tạo ra sự bảo hộ ngay cả với vi rút dị chủng có giá trị r1 thấp (Trần Xuân Hạnh, 2020). Ở chiều ngược lại, giá trị r1 giữa chủng O1 Manisa và O1 Campos khá cao (r1 = 0,64), có nghĩa là 2 chủng vi rút này có tính tương đồng về kháng nguyên. Gây miễn dịch cho động vật bằng tiêm vắc xin chứa 3,75 µg/ liều. Kết quả công cường độc đồng chủng với O1 Manisa bảo hộ 100%. Kết quả công cường độ dị chủng với O1 Campos chỉ có tỷ lệ bảo hộ 28,6% đến 60%. Chỉ khi động vật được gây miễn dịch với vắc xin có nồng độ kháng nguyên cao (60 µg/ liều) tỷ lệ bảo hộ mới tăng cao từ 75% đến 100% khi công cường độc với chủng virus dị chủng (Trần Xuân Hạnh, 2020). Theo nghiên cứu của Boehringer Ingelheim “chỉ số tin cậy” nên được dùng để đánh giá hiệu của của vắc xin. “Chỉ
số tin cậy” (bảng 2.3) là kết hợp giữa giá trị r1 và hiệu giá trung hòa vi rút dị chủng (Trần Xuân Hạnh, 2020).
Bảng 2.3. Chỉ số tin cậy trong đánh giá hiệu quả vắc xin
TT Chỉ tiêu đánh giá
1 2 3 4
* log 10 hiệu giá kháng thể trung hòa (HGKT)
2.5. TÌNH HÌNH PHÁT TRIỂN VẮC XIN LMLM TRÊN THẾ GIỚI2.5.1. Vắc xin LMLM vô hoạt 2.5.1. Vắc xin LMLM vô hoạt
Vắc xin sống được sử dụng rộng rãi để ngăn ngừa hầu hết các bệnh do vi rút và các hoạt động nghiên cứu cho việc phát triển các vắc xin LMLM sống nhược độc cũng đang được tiến hành. Tuy nhiên hiện nay, tất cả các vắc xin LMLM được sử dụng trên toàn thế giới là vắc xin vô hoạt.
Năm 1927, với thành công bước đầu trong phòng thí nghiệm làm suy yếu vi rút, các nhà nghiên cứu đã tập trung phát triển vắc xin nhược độc. Năm 1950, Frenkel và cộng sự đã nghiên cứu nuôi cấy vi rút LMLM trên môi trường tế bào biểu mô lưỡi sơ cấp và vô hoạt bằng formaldehyde. Tuy nhiên, phương pháp này có những hạn chế như khả năng nuôi cấy trên tế bào sơ cấp thấp và vô hoạt bằng formaldehyde thường không hoàn toàn. Vào thập niên 60, các nhà khoa học đã sử dụng tế bào BHK dạng treo thay thế tế bào biểu mô lưỡi để nuôi cấy vi rút và sử dụng chất vô hoạt là ethylene imines thay cho formaldehyde (Rodriguez & Gay, 2011). Ngày nay, người ta sử dụng tế bào BHK để nuôi cấy vi rút và phương pháp của Frenkel được xem là nền tảng cho việc sản xuất vắc xin nhiều năm sau.
Ngày nay, đại đa số các vắc xin LMLM thương mại được sản xuất từ kháng nguyên tinh sạch vô hoạt là các protein cấu trúc phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu. Nhiều công thức vắc xin đã được chứng minh có hiệu quả trong việc phòng và khống chế dịch bệnh LMLM ở các nước Nam Mỹ, châu Âu và châu Phi. Đối với vắc xin được sử dụng trong trường hợp khẩn cấp, do tính không ổn định của công
thức vắc xin, vắc xin thường được lưu trữ ở dạng đông lạnh kháng nguyên và tập trung thành ngân hàng vắc xin ở các quốc gia sạch bệnh. Ví dụ, khối liên kết Mỹ, Canada và Mexico có ‘‘ngân hàng vắc xin LMLM Bắc Mỹ’’. Công thức vắc xin bằng cách đông lạnh kháng nguyên gồm ít nhất 6PD50, có khả năng bảo hộ trong 4 – 7 ngày tiêm vắc xin sử dụng trên gia súc, lợn và cừu và kháng nguyên có khả năng bảo hộ toàn bộ các subtype trong một serotype (Golde & cs., 2005).
Vắc xin nhũ dầu thông thường chứa ít nhất 3PD50. Vắc xin làm giảm các triệu chứng lâm sàng và sự nhân rộng của vi rút nhưng không thể ngăn chặn sự hình thành quá trình lây nhiễm (lên đến 50%) của các chủng thực địa. Miễn dịch tạo bởi vắc xin nhũ dầu chỉ kéo dài khoảng 6 tháng, do đó, cần tiêm nhắc lại. Tuy nhiên, phản ứng miễn dịch sớm hay muộn tuỳ thuộc vào từng loài gia súc (ví dụ như: dê có đáp ứng miễn dịch muộn hơn so với bò) và ngưỡng bảo hộ ở các loài như: Cừu, dê hoặc trâu cũng khác nhau hoặc vẫn chưa có tiêu chuẩn cụ thể. Nhìn chung, khả năng bảo hộ đạt trên bê thì được xem như là đạt trên các loài khác (Oie, 2018). Hiệu quả sử dụng vắc xin nhũ dầu trên dê vượt trội hơn hẳn khi sử dụng vắc xin keo phèn.
Công thức vắc xin sử dụng Al(OH)3 – saponin có một số ưu điểm như: quá trình sản xuất đơn giản, kháng nguyên bám vào các hạt gel Al(OH)3. Tuy nhiên, vắc xin có các nhược điểm như: có thể gây sưng cục ở vị trí tiêm, hiệu quả không cao và độ dài miễn dịch ngắn hơn vắc xin nhũ dầu. Mặc dù vậy, trên thế giới, vắc xin vô hoạt keo phèn vẫn đang được sản xuất và sử dụng cho đa số động vật nhai lại (Doel, 2003; Valtulini & cs., 2005).
2.5.2. Một số thử nghiệm vắc xin mới
Về hướng nghiên cứu phát triển vắc xin LMLM, bên cạnh loại vắc xin truyền thống là vắc xin vô hoạt, đã có nhiều nghiên cứu phát triển vắc xin thế hệ mới phòng bệnh LMLM, có thể kể đến vắc xin tiểu phần (subunit vắc xin), vắc xin nhược độc, vắc xin vector tái tổ hợp, v.v... Mặc dù có ưu điểm là cho phép phân biệt giữa kháng thể do nhiễm tự nhiên và do tiêm vắc xin, độ dài miễn dịch kéo dài; các loại vắc xin thế hệ mới còn tồn tại nhược điểm như hiệu quả còn thấp và có nguy cơ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp hoặc cường độc trở lại (Zhang & cs., 2011). Có thể thấy, tính đến thời điểm hiện tại, hướng sản xuất vắc xin vô hoạt phòng bệnh LMLM vẫn chưa thể thay thế được và vẫn là loại vắcxin duy nhất dùng để phòng bệnh LMLM trên thế giới.
2.5.3. Các vắc xin LMLM hiện hành
Một số vắc xin đang sử dụng trên thế giới: Hiện nay, có rất nhiều loại vắc xin được sử dụng do các công ty Merial, Intervet và Pfizer theo nguyên lý công nghệ như nhau. Nuôi vi rút LMLM trên tế bào BHK21 dạng treo và làm vô hoạt
vi rút bằng BEI, cô đặc và làm sạch kháng nguyên vi rút trước khi phối hợp với chất bổ trợ nhũ dầu kép hoặc keo phèn kết hợp với Saponin.
Các vắc xin có bổ trợ keo phèn đáp ứng miễn dịch nhanh và mạnh, trong khi đó vắc xin nhũ dầu kép gây đáp ứng miễn dịch tuy chậm hơn nhưng kéo dài. Vắc xin LMLM có thể chứa 1 serotype (O hoặc A hoặc C) hay nhiều serotype.