Phần 3 Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.5.2.Phương pháp chuẩn độ vi rút và trung hòa vi rút trên tế bào
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2.Phương pháp chuẩn độ vi rút và trung hòa vi rút trên tế bào
3.5.2.1. Phương pháp chuẩn độ vi rút
Xác định chỉ số TCID50 (liều tại đó gây chết 50% giếng tế bào mà có CPE) bằng phương pháp chuẩn độ vi rút trên tế bào dạng treo, tính toán theo Spearman và Karber như sau: Log TCID50 = X0 - d/2 + d x ri/ni
Trong đó: X0: nồng độ pha loãng cao nhất mà tại đó tế bào có bệnh tích là 100%; d: khoảng cách pha loãng; ri: tổng giếng tế bào có bệnh tích từ nồng độ X0; ni: số giếng tế bào gây nhiễm ở mỗi nồng độ.
Vi rút LMLM được pha loãng theo cơ số 10 (từ 10-1 đến 10-8) trong môi trường DMEM. Trên đĩa 96 giếng, cho 100 µl huyễn dịch vi rút vào các giếng tương ứng. Cho 100 µl tế bào, lắc nhẹ, ủ đĩa và theo dõi trong 2 ngày. Đọc kết quả ghi số giếng có CPE, tính TCID50 theo công thức.
3.5.2.2. Phương pháp trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào (VNT)
Theo hướng dẫn của OIE (Oie, 2018) trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào sử dụng dung dịch tế bào BHK21 dạng treo. Quá trình thực hiện trên đĩa nuôi cấy 96 giếng, nồng độ tế bào là 50000 tế bào/giếng.
Vi rút LMLM O/FMD/Avac3 được pha loãng trong dung dịch DMEM, lấy nồng độ trung hòa là 100 TCID50/giếng. Huyết thanh 0, 28 và 56 ngày được diệt bổ thể ở 560C/30 phút; pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 từ 1/8 đến 1/512. Mỗi bậc pha loãng huyết thanh được lặp lại 2 lần (2 giếng). Vi rút trộn với huyết thanh theo tỷ lệ 1 : 1 (50 µl : 50 µl), ủ 370C/60 phút rồi thêm 50 µl tế bào đạt nồng độ 50000 tế bào/giếng vào, đem nuôi ở tủ ấm 370C /5% CO2. Theo dõi bệnh tích tế bào, sau 2 ngày đọc kết quả. Đọc kết quả theo hướng dẫn của OIE: dương tính (+): tế bào ở giếng phản ứng không bị phá hủy, âm tinh (-): tế bào ở giếng phản ứng bị phá hủy, bong khỏi đáy giếng, để lại khoảng trống. Hiệu giá trung hòa 50% được tính theo phương pháp Spearman-Karber: LogVNT50 = Xo + d/2 - d∑ri/ni
Trong đó: Xo là Log10 của nghịch đảo độ pha loãng huyết thanh cao nhất;
d:log10 của khoảng cách pha loãng; r: tổng số giếng dương tính; n: số giếng cho một độ pha loãng
Đọc kết quả: (i) âm tính nếu log10 VNT50 ≤ 1,21 (1/16); (ii) dương tính nếu log10 VNT50 ≥ 1,65 (1/45); (iii) nghi ngờ nếu log10 VNT50 trong khoảng 1,21 (1/16) đến 1,5 (1/32). Phản ứng thử được xem xét lặp lại nếu kết quả lặp lại cao hơn 1,21 (1/16) được xem là dương tính, ngược lại là âm tính.
Theo TCVN 8685 -10: 2014 (Tiêu Chuẩn Quốc Gia 8685, 2014) vắc xin đạt tiêu chuẩn khi hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút là 1/100 (khi vắc xin có tính tương đồng kháng nguyên).
Đánh giá tính tương đồng kháng nguyên giữa các vi rút vắc xin và vi rút thực địa theo phương pháp tính tương quan r1 (Serological relationship: r1 – value). Công thức tính giá trị r1:
r1 = Hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hoà với vi rút Hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hoà với vi rút vắc xin
Giá trị r1 ≥ 0,3 được xem như vi rút vắc xin có tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa.
Giá trị r1 < 0,3 được xem như vi rút vắc xin không tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa.
3.5.3. Phương pháp cô đặc, vô hoạt, phối trộn với chất bổ trợ và kiểm tra vắc xin khi phối trộn